Dosahujeme výše: Vývoj Gazyvara – část 1. Reaching higher: The development of GAZYVA - part 1

Přednáška přibližuje vytvoření molekuly Gazyvara a některé preklinické vlastnosti této látky, podává vědecký náhled na odlišnosti mechanismu působení obinutuzumabu a rituximabu, které se převádějí do mechanismu působení a potažmo do nadřazené klinické aktivity.

TIP: Pro lepší zážitek zvolte režim "Celá obrazovka" (ikonka vpravo dole na liště)

Video

Textový přepis

Tip: Kliknutím na místo v textu, přetočíte přehrávané video.

Dobré ráno. Je pro mě velkým potěšením být zde. Děkuji. Děkuji za uvedení a děkuji vám všem za participaci ve studii a na tomto meetingu. Prvních 15 minut věnuji vytvoření molekuly a některým preklinickým vlastnostem. Takovou informaci z etikety jste již viděli. Jak jsme lék vyrobili? Michael už vám ukazoval časovou osu a na úplném začátku, než jsme vytvořili Gazyvaro, první věcí, kterou jsme vytvořili, byla technologie k modifikaci glykosylace protinádorové protilátky, jejího vzorce glykosylace (glykoinženýring). Jak víte, konstantní oblastí protilátky je složka proteinová i sacharidová a ta sacharidová část modifikuje strukturu Fc oblasti, té konstantní oblasti a to ovlivňuje, jak tato část protilátky, která je společná pro IgG1 protilátky, interaguje s Fc gama receptory efektorových buněk imunitního systému, čili přirozených zabíječů (NK buněk), makrofágů, neutrofilů apod. V zásadě to, co jsme vytvořili, do detailů půjdeme později, byla technologie k modifikaci cukrů připojených k této části protilátky, a to ovlivňuje afinitu k Fc gama r 3 receptorům, aktivačním receptorům, který se nachází na NK buňkách, makrofázích, a také na neutrofilech a tím se mění jejich efektorová funkce v imunitním systému, jako je na protilátkách závislá buněčná cytotoxicita (ADCC – antibody dependent cellular cytotoxicity), nebo na protilátkách závislá buněčná fagocytóza (ADCP). Jakmile jsme měli vyvinutou technologii na konstantní část, lze ji aplikovat na mnoho protilátek. Takže bylo zapotřebí zvolit cíl, na který to chceme aplikovat, a zaměřili jsme se na CD20, jakožto na kandidáta pro první lék. Důvodem pro vybrání CD 20 samozřejmě bylo, že již v roce 2002, 2003 Mabthera byla velmi úspěšný lék, ale stále zde byla medicínská potřeba, a také přetrvávala myšlenka, že mechanismus založený na ADCC významně přispívá k způsobu, jakým funguje Mabthera. Takže naše myšlenka byla – tady je něco, co funguje, stále je potřeba i možnost to ještě zlepšit a alespoň částí toho dobrého fungování je něco, na co nyní máme technologii, jakou se můžeme pokusit to ještě vylepšit. Pojďme technologicky pozměnit profil glykosylace protilátky CD20. Nicméně, již v tu dobu mnoho firem a pracovních skupin pracovalo na druhé generaci, nebo nazývejme to další generací CD20 protilátek. Takže jsme si řekli, hledejme antiCD20, která kromě odlišného profilu glykosylace má ještě jiné odlišnosti. Tak jsme se zaměřili na hledání něčeho, co nazýváme CD20 protilátka druhého typu. To vysvětlím za vteřinku, co to znamená. Ale obecně navázáním CD20 molekuly na povrch B buňky jiným způsobem vyžaduje molekulu s jinými vlastnostmi. Víte, že hlavním způsobem fungování konjugované antiCD20 protilátky je přímé usmrcování buněk tím, jen navázáním určité části protilátky CD20 se indukuje signalizace, která přímo vede ke smrti buňky. Protilátky II.typu jsou lepší v této indukci, než protilátky I.typu. Pak je tu ADCC část reakce, která jde cestou Fc gama receptoru efektorových buněk imunitního systému, a jak protilátky I., tak II.typu , toto dovedou, ale my jsme vylepšili tuto část změnou profilu glykosylace. Pak je tu na komplementu závislá buněčná cytotoxicita, a zde, na rozdíl od mechanismu přímé buněčné smrti, protilátky II.typu mají nižší podíl aktivace na komplementu závislé buněčné cytotoxicity. Takže většina antiCD20 protilátek váže CD20 antigen stejným způsobem jako rituximab. A ty se nazývají typu I. Velmi vzácné jsou protilátky, které k molekule CD20 přistupují odlišně. A těmto protilátkám se začalo říkat protilátky II.typu. Tento název přišel od profesora Martina Glennieho z University South Hampton v roce 2002. A první přišla experimentální sledování, která jsou shrnuta v této tabulce. První, co je velmi podivné, jak už jsem vám řekl, ty protilátky vážou CD20 odlišným způsobem, a také v okamžiku saturace. Pokud saturujete B buňku protilátkou prvního typu, jako je Mabthera, nebo protilátkou druhého typu, jako je Gazyvaro, vejde se tam pouze polovina protilátek druhého typu, v porovnání s prvním. A není to proto, že jedny by se vázaly jedním ramenem, a ty druhé dvěma, Fab ramena, ale obě protilátky se vážou dvěma rameny. Takže se zde odehrává něco jiného, co je odlišuje a nyní vám vysvětlím, jaký pro to máme model. Další věcí, co zde vidíme je, že protilátka typu I. in vitro vede k rychlé homotypické agregaci, tvorbě clusterů B buněk, zatímco protilátky II.typu to dělají jen ve velmi malém rozsahu. Už jsem zmínil, a ukážu vám k tomu ještě nějaké data, že je zde velmi silná indukce přímé buněčné smrti. Je to forma programované buněčné smrti, ale ne úplně apoptóza, v čemž jsou protilátky I. typu o mnoho slabší. Dále protilátky I. typu, ale ne už tak protilátky II.typu, fixují molekulu CD20 v mikrodoméně plasmatické membrány B buňky, nazývané lipidové rafty. Výsledkem této tvorby clusterů váže CD20 molekulu uvnitř těchto mikrodomén. Tento cluster Fc fragmentů je velmi dobrým, substrátem pro navázání C1q, prvního proteinu komplementové kaskády. Proto protilátky typu I. jsou velmi dobré ve vyvolání odpovědi na komplementu závislé, a protilátky typu II.jsou slabší ve vyvolání lýzy závislé na komplementu. Potom, také díky lokalizaci tohoto lipidového raftu, kde se na B buňkách nalézají také inhibiční Fc gamma r 2b, výsledkem toho, u některých buněk, zvláště u těch, které mají vyšší hladiny Fc gamma r 2b receptorů, může dojít k downregulaci CD20 proteinu. Vymizení CD 20 proteinu je mediované typem I. protilátek. Typ II.protilátek, vzhledem k tomu, že neumisťují do lipidových raftů, kde se nacházejí Fc gamma r 2b, nezprostředkovávají tuto reakci a udržují tak CD20 molekulu na buněčném povrchu po celý čas. A nakonec si řekněme, že poslední dobou se ukazuje, že tento mechanismus programované buněčné smrti, navzdory protilátce antiCD20 II.typu, je velmi imunogenním způsobem smrti B buňky, jelikož molekulární vzorce poškození buněk dávají silný signál antigen prezentujícím buňkám a silný priming pro tvorbu adaptivní imunitní odpovědi, v porovnání s typem I.protilátek. Jak můžeme, když máme stejnou CD20 molekulu, a je tam jen malý kousek CD molekuly, který vykukuje z buněčného povrchu, ve skutečnosti tak malý kousek molekuly, že nemůžete mít dvě CD20 protilátky, které by mezi sebou nekompetovali. Vždycky dvě antiCD20 protilátky budou mezi sebou soutěžit, protože tam není mnoho prostoru, na této malé části – takže jak se mohou vázat natolik odlišně na CD20? Zohledníme-li bod, že navázat se může vždy jen polovina molekul protilátek typu II. Odpovědí je, že CD20 samo o sobě, není monomer na buněčném povrchu, je to tetramer. Nachází se tam v podobě oligomeru. A co je jiné, u protilátek prvního versus druhého typu je způsob, jakým se přibližují k tetrameru. V případě protilátek prvního typu se protilátka váže jedním ramenem na jednu jednotku tetrameru, druhým ramenem na jiný tetramer. Na ostatní jednotky tohoto tetrameru se mohou umístit jiné antiCD20 protilátky. U protilátek II.typu se obě ramena navazují na jednotky jednoho tetrameru. A neumožňuje to – blokuje to více CD20 molekul v rámci jednoho tetrameru. Je tedy zjevné, že úhel, pod jakým se protilátky přibližují k molekule, a flexibilita těch ramen protilátky ovlivňuje způsob navázání, kterým se liší jeden typ protilátek od druhých. Výsledkem toho, to co vidíme, když se váže jedním ramenem jeden tetramer, druhým ramenem druhý tetramer, jako je tomu v případě rituximabu, Mabthery, je formování velké sítě. CD20 tetramer se napříč spojuje s protilátkou, to vede ke stabilizaci v lipidovém raftu, kde se nachází inhibiční Fc gamma r 2b receptor, vzniká tak velmi dobrý substrát pro navázání C1 q, což je hexamer protein. Pro C1 q toto uskupení vypadá lákavě, protože všechny ty Fc tam již jsou shluknuty. Toto se u protilátek II.typu neděje, proto máme méně na komplementu závislé cytotoxicity, ale naopak, vázání se oběma rameny na jeden CD20 tetramer, jak jsme byli schopni pozorovat také kryoelektronovou mikroskopií, intracelulární domény CD20 molekul se shluknou. A to spouští signalizaci, které stále ještě plně nerozumíme, ale vede to ke změnám, které vám ještě ukážu, jsou to změny v signalizační kaskádě, která zesiluje mechanismus přímé buněčné smrti – neapoptotická cesta buněčné smrti. Teď nepůjdu úplně do detailů, ale jak už jsem zmínil, toto bylo objeveno a publikováno opět pracovní skupinou okolo Martina Glennieho ze South Hampton, že když u CLL B buňky mají vyšší hladiny Fc gamma r 2b receptoru, pak protilátky I.typu po čase mohou vést ke ztrátě CD20 molekuly z buněčného povrchu, ale u protilátek II.typu se toto neděje. A také je důležité, jak vám ještě vysvětlím později, modifikovali jsme cukerný zbytek Fc oblasti Gazyvara a tím jsme ovlivnili navázání na Fc gamma r 3 receptor, aktivační receptor, ale neovlivnili jsme vázání na Fc gamma r 2b, v tomto ohledu je ta technologie dosti selektivní, čili nedochází k té downregulaci. Co ovlivňuje to, že se molekula protilátky může přiblížit k tetrameru CD20 molekuly touto zvláštní cestou – oběma rameny, jak je tomu tady. Jedna věc je úhel, pod kterým přistupuje k epitopu. Tady máte krystalickou strukturu cyklického peptidu se sekvencí intracelulární kličky CD20, tohle je Mabthera, vázající se na to, a toto je Gazyvaro Fab, vázající se na to. Jak můžete vidět, epitopy se překrývají, ale nejsou identické, přistupují k molekule pod různými úhly. Další věcí, na kterou jsme přišli, že v průběhu humanizace rodičovské protilátky, které vedla ke vzniku Gazyvara, nazývané BIy1 – v průběhu humanizace této protilátky jsme vytvořili mnoho různých variant. Testovali jsme mnoho různých variant. A protože jsme hledali velmi dobrou protilátku typu II., screenovali jsme všechny tyto varianty v assay, které má totožné vlastnosti s protilátkou II.typu, mechanismus přímého buněčného usmrcování. Takže dáte buňky lymfomu, v tomto případě to byla linie lymfomu z plášťových buněk, dáte tam protilátku a sledujete indukci buněčné smrti. Bez komplementu, bez ADCC… A můžete vidět, že Gazyvaro je mnohem lepší v indukci této buněčné smrti v této assay. Tady je pozitivní kontrola. Nicméně když jsme se pak podívali na všechny varianty, které jsme v průběhu humanizace vytvořili, spatřili jsme, že některé mají tento silnější charakter II.typu v indukci buněčné smrti, a jiné ne. Jiné vypadají spíše jako Mabthera, můžeme říci. A když jsme se podívali na to, v čem jsou ty rozdíly, definovali jsme jednotlivá residua. Toto se nazývá elbow-hinge (loketní závěs). Není to typický způsob ukotvení pro protilátku, to vidíme tady, Fc a Fab, je to ukotvení v rámci Fab ramene, elbow-hinge, které reguluje také flexibilitu Fab ramen. A pouhou změnou tady toho rezidua, původní reziduum rodičovské protilátky – vede ke ztrátě charakteru protilátky II.typu, co má Gazyvaro. Co je zajímavé, začíná se chovat spíše jako protilátka I. typu. Uchycuje více oblastí na povrchu, více indukuje na komplementu závislou cytotoxicitu. Minimálně v případu Gazyvara, jak úhel, tak flexibilita ramen určují navazování modu II.typu. Tato indukce přímé buněčné smrti jsme viděli iniciálně, když jsme dělali screening, až po finální variantu Gazyvara. Pak jsme to testovali na různých typech buněčných linií lymfomů. Jak můžete vidět tady, napříč celým spektrem, Gazyvaro, Mabthera v modrém a neléčení pacienti v červeném, zde napříč celým spektrem je zesílený mechanismus přímé buněčné smrti. Jak už jsem zmínil, je to neapoptotická cesta. S několika investigátoři jsme pracovali na tomto shrnutí, které bylo publikováno britskou pracovní skupinou, že některé kroky, které tento modus přímé indukce buněčné smrti požaduje, byly identifikovány – od tvorby clusterů intracelulární domény CD20, k první části, kterou vidíme tady, reorganizace aktinu cytoskeletu a homotypická adheze, nevíme přesně, co se děje, ale víme, že toto se musí stát, pokud inhibujete inhibitory polymerizaci aktinu, pak nedojde k přímé buněčné smrti, pak máme lysozomální permeabilizaci, uvolnění katepsinu, dojde k reakci s reaktivním kyslíkem, což vyžaduje NADPH oxidázu, tu můžeme blokovat inhibitory NADPH oxidázy a to vede k neapoptotické buněčné smrti. Abych vám ukázal, jak to vypadá naživo v laboratoři, mám tu velmi krátký záznam, kdy jsme vzali buněčnou linii lymfomu z plášťových buněk se čtyřmi různými protilátkami. Tady jen pro kontrolu buněčná linie, zde dvě protilátky I. typu, Mabthera a ofatumumab, a zde Gazyvaro. Pak jsme přidali se zelenou fluoresceční barvou anexin 5, když dojde k disrupci buněčné membrány, dostanete fosfatidylserin a anexin 5 se mohou navázat. A když jsou buňky opravdu hodně poškozeny, pak v červeno-oranžové propidiumjodidu to vidíme, protože penetruje do buněk a fixuje v jádře. Takže když dojde k zabíjení buněk, vidíte to tak, že zezelenají, případně se stanou uvnitř červenými. Toto vše bylo děláno ve stejný čas a filmováno mikroskopem a zde je to akcelerováno do pár sekund. Takže vidíte, že tento první mechanismus je bodem, který odlišuje protilátky I.a II.typu., jako je Gazyvaro. Nyní k inženýringu Fc části, to je modifikace té cukerné části – nepůjdu úplně do detailů, ale nejdůležitější částí modifikace cukru je odstranění fukózy. Když tam nemáte reziduum fukózy v tomto cukru – toto je struktura Fc části protilátky, toto jsou dvě části, v modré a červené, v komplexu s Fc gamma receptorem. Tady je fukózové reziduum. Když odstraníte fukózové reziduum, pak cukru z receptorové strany umožníte další místo kontaktu. To jsme zjistili na podkladě mitogeneze, pak jsme to potvrdili rozpuštěním 3D krystalické struktury komplexu. A toto je důležité. Protože to vyžaduje pouze cukr aktivačního Fc gamma 3 receptoru, ne inhibiční receptor, byl na tomto místě. Jinak je ta styčná plocha poměrně konzervativní napříč Fc gamma receptory. Proto odstranění fukózy z protilátky zvyšuje afinitu pouze pro aktivační Fc gamma 3 receptor, a ne pro další receptory. A jak už jsem říkal, potvrdili jsme tento model rozpuštěním krystalické struktury. Toto se přenáší do posílené ADCC. Jak je ukázáno zde, in vitro a ve srovnání s ofatumumabem a Mabtherou, jak síla, tak účinnost, zesilují ADCC. Nejenom, že je posílena ADCC, ale Fc gamma receptor je přítomen také na monocytech, makrofázích a neutrofilech, a neutrofily mají Fc gamma 3b formu receptoru, a to vede k dalším vylepšeným vlastnostem. V případě monocytů a makrofágů to vede jak k posílení ADCC, ale také ADCP, čili na protilátkách závislou buněčnou fagocytózu. V případě neutrofilů to vede k zesílení aktivace a také zesílené fagocytózy. Ne ADCC v případě neutrofilů; mějme na paměti, že Fc gamma 3b receptor nemá doménu přímé signalizace, to je gpi anchor protein a komunikace mezi povrchem a anchor vede k zesílení ADCP. A také jsme prokázali, že zesílení ADCC je natolik silné, že to přepisuje inhibici cílových buněk, například buňky CLL mají mnoho ligandů pro „zabíječský“ receptor NK buněk. Když vezmeme všechny mechanismy fungování dohromady, čili zesílenou ADCC, zesílenou ADCP, NK buňky, monocyty, makrofágy, neutrofily, posílený mechanismus přímého buněčného usmrcování, ale redukovanou na komplementu závislou cytotoxicitu, a chceme vidět, jak všechny ty věci fungují dohromady v jednotlivé assay, tak jsme to udělali na plné krvi pacientů s CLL, toto bylo ve spolupráci s Larkem Ysebaertem, a tady můžete vidět, bylo to ve spolupráci i s dalšími investigátoři a tato data již jsou publikovaná, ale tady máte shrnutí, okolo 100 pacientů, klasifikovaných na základě několika genetických abnormalit a napříč toho celého, když se podíváme na totální depleci B buněk, v plné krvi, vidíme mnohem lepší depleci B buněk u Gazyvara v porovnání s Mabtherou. To bylo in vitro, teď jak to vypadá in vivo? Toto je model agresivního lymfomu u myší, kterým jsme implantovali lidský nádorový xenograft, a vidíme zde růst nádoru dle váhy zvířete. Když jim dáme Mabtheru, vidíme v šedé, 1, 10 nebo 30 mg/kg, můžeme snížit růst nádoru, ale už v takovém rozsahu, který je mezi 10 a 30 mg/kg nevidíte, že by se zvyšovala účinnost, v tomto modelu, s vyšší dávkou Mabthery. Zatímco u Gazyvara můžeme jít od 1, k 10 a 30 mg/kg, a zvláště zde, u vyšší dávky vidíte regresi nádoru a ve skutečnosti i eradikaci, v tomto modelu. Tady jen shrnutí. Vygenerovali jsme protilátku, která váže CD20 odlišným způsobem, nazývaným typ II. model vazby. Výsledkem toho tato antiCD20 protilátka ve zvýšené formě indukuje přímo buněčnou smrt, indukuje také imunogenní buněčnou smrt, která instruuje antigen prezentující buňky lépe, než protilátky I. typu, má redukovanou CD20 internalizaci a ztrátu CD20 antigenu z povrchu buněk, v porovnání s typem I. protilátek a také má nižší nebo redukovanou na komplementu závislou cytotoxicitu, v porovnání s typem I. protilátek. To je po stránce typu protilátky. Z pohledu „glykoinženýringu“ Fc tu máme vyšší afinitu k Fc gamma 3 receptoru, zesílenou ADCC prostřednictvím NK buněk, makrofágů a monocytů, zesílenou ADCP, fagocytózu, posílenou vazbu na monocyty, makrofágy a neutrofily a snížený je dopad na inhibiční „zabíječský“ receptor (KIR). Máme dva hlavní způsoby fungování k odlišení. Jelikož typ II.protilátek zvyšuje přímé usmrcování buněk, a ten druhý, díky technologicky upravenému glykosylovanému konci, posiluje imunitní funkce efektorových buněk, ADCC a ADCP. Otázka na vás, jen abych se ujistil, že jsem vás neuspal. Jaký typ protilátky je Gazyvaro? Možnosti odpovědí si přečtěte zde. Typ I antiCD20 protilátky s posíleným mechanismem přímé buněčné smrti a technologicky upraveným (glykoinženýring) sacharidovým koncem k posílení ADCC; nebo typ II protilátky s oslabeným mechanismem přímé buněčné smrti a technologicky upraveným (glykoinženýring) sacharidovým koncem k oslabení ADCC; nebo typ II protilátky s posíleným mechanismem přímé buněčné smrti a technologicky upraveným (glykoinženýring) sacharidovým koncem k posílení ADCC? Prosím odpovídejte. Dobře, děkuji, za C. Nyní předávám Guillaumovi. A ještě než přijde, chtěl bych poděkovat celému týmu, který stojí za objevením a vývojem, a také všem investigátorům, každému z vás, kteří nám pomáhali a pacientům a jejich rodinám.

Good morning. It's a great pleasure to be here, thank you. Thank you for introduction and thank you to all of you for participating in this meeting. So I will take you first quickly in about fifteen minutes or so through the generation of the molecule and some of the preclinical properties. So you have seen already this information about the label so I move quickly to how we´ve made the drug. Michael has already shown you the timeline and at the very beginning before we made Gazyva, the first thing that we did was to generate the technology to modify the glycosylation pattern of anti cancer antibody. So as you know the constant region of the antibody is made of both protein and sugar. And the sugar part modifies the structure of Fc region or constant region and that affects how this part of the antibody which is common among all the IgG1 antibodies - it influences how this part interacts with the Fc gama receptors on innate immune effector cells such as natural killer cells or macrophages, neutrophils and so on. So basically what we´ve developed and I will go into more details later was a technology to modify the structure of the sugars attached to this part of the antibody. And that in turn influence the affinity to the Fc gama r 3 receptor, the activating receptor found in NK cells, macrophages, also in neutrophils. And that in turn enhance the immune effector functions from this cells such as antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP). Once we had developed a technology since this is in the constant part, you could apply this to many antibodies so we had to choose a target to which to apply the technology first and we focused on CD 20. It´s our first drug candidate. And the reason for choosing CD 20 obviously was because already that time 2002, 2003 it was very clear that Mabthera was a very successful drug but also there was still a medical need and also it was known at that time or at least thought that the ADCC mechanism contributed significantly to the mode of action of Mabthera. So we thought - okay, here is something that is working, there is still a need and it´s possible to improve and at least part of the way it works is through a mechanism for which we have a technology to try to enhance it. So we thought - okay, let´s go to glycoengineer CD 20 antibody. However already at that time there were many companies, many groups already working on second generation or next generation and called them CD 20 antibodies. So we thought - in addition to the glycoengineering engineering let's try to look for CD 20 antibody that has additional differences. And that's when we focused on looking and generating so called type two CD 20 antibody. I will explain you in a second what this is. But basically by virtue of binding to the CD 20 molecule on the surface of B cells in a different way this endows the molecule with different properties. You know that the main modes of action of unconjugated anti CD 20 antibodies are via direct cell death induction. Just upon binding of the variable region of the antibody to the CD 20 molecule you can induce signalling that leads to direct cell death. And the type two antibodies are better at doing that then the type one antibodies. Then you have the ADCC part which is via engagement of Fc gama receptors on immune effector cells. And both type one and type two antibodies can do that. But we enhanced that part through the glycoengineering. And then there is the compliment dependent cytotoxicity and here in contrast to the direct cell death the type two antibodies have lower induction of complement dependent cytotoxicity. So most of the anti CD 20 antibodies out there bind the CD 20 molecule very similar to rituximab. And these antibodies are called type one. But there are very very few rare CD 20 antibodies which approach the CD 20 molecule in a very different way. And these antibodies then became called type two CD 20 antibodies. It this was a term that was coined by professor Martin Glennie from the University of Southampton back in 2002. The first thing that came where a number of experimental observations which are summarised in this table. First thing which is very peculiar (as I´ve already told you), that molecules are binding CD 20 in a very different way, is that at saturation. If you saturate the same B cell with the type one antibody like Mabthera or a type two antibody like Gazyva, you can only accommodate half the number of antibody molecules for the type two as compared to the type one. And this is not because one binds with one arm and the other one binds with two arms of the Fab arms of the antibody. No, we know from the binding curves that both antibodies are binding with two arms. So we know that something is going on there that is different and I will explain you the model that we have for that. Then another think that is observed is that type two antibodies in vitro lead to a very rapid homotypic aggregation, clustering of the B cells in vitro. Whereas the type one antibodies do this to a very low extent. Then I´ve already mentioned and I will show you some data that there is a very strong induction of direct cell death. It's a form of program cell death but is not really apoptosis. Whereas the type one antibodies are much weaker at this. Then the type one antibodies but not the type two fix the CD 20 molecule within microdomains in the B cell surface, the so called lipid rafts. And as a result of this clustering of the CD 20 bound antibody molecules in these microdomains you have this cluster of Fcs that it is a very good substrate for the binding of C1q. The first protein from the complement cascade. And therefore type one antibodies are very good at complement related lysis, whereas type two are weeker at complement related lysis. Then also because of the localisation to this lipid rafts where also the inhibitor of Fc gama r 2b receptor is found on B cells - as a result of that there is in some cells, particularly if they have higher levels of Fc gama r 2b, there can be downregulation of the CD 20 protein over time and disappearance of the CD 20 protein and the antibody from the cell's surface that is mediated by the type one antibodies. The type two antibodies, because they don't localise to these lipid rafts where the Fc gama r 2b is present, they do not mediate this and the remain and maintain the CD 20 molecule on the surface over time. And finally more recently it has been shown that this program cell death mechanism induced by the type two CD 20 antibodies is a very immunogenic form of killing the B cells in the way that a molecular patterns of the damage of the cells give a stronger signal to the antigen presenting cells and a stronger priming for the generation of an adaptive immune response. As compared to the type one antibodies. So how come if you have the same CD 20 molecule and there is only a little bit of the CD 20 molecule that comes out of the surface of the cell. Indeed you can - this part of the CD 20 is so small that you cannot have two CD 20 antibodies that do not compete with each other. All CD 20 antibodies will compete with each other because there is not a lot of the space in this small portion. So how come you can bind so differently to CD 20? To the point that you can only fit half the number of molecules for the type two antibody. The answer is that CD 20 cell is not a monomer on the cell's surface - it ´s a tetramer, it is found as an oligomer. And what is different is how the molecules then, the type one versus the type two, approach this tetramer. So in the case of the type one antibodies the antibody binds with one arm on one unit of a tetramer and the other arm on a different tetramer. And therefore the other units here within this tetramer can accommodate all their CD 20 antibodies in that tetramer. Whereas with the type two antibodies both arms are binding within a single tetramer. And you block, you do not allow binding for more CD 20 antibody molecules within that same tetramer. So obviously the angle at which the Fab arm approaches the molecule and the flexibility of those antibody arms that influences how you can switch from one binding mode to the other binding mode. As a result of that then this is what is observed. When you have the binding with one arm in one tetramer and other arm in the other tetramer like in the case of rituximab Mabthera, then you for this big networks. CD 20 tetramers cross-linked by the antibodies and as I said this leeds to the stabilistation of the CD 20 molecule with the antibody in the lipid rafts where also the inhibitors of the rc gamma r 2b receptor is found. And you have a very good substrate then for binding of C1q which is a hexamer protein. So for C1q this looks very good. You have already preclustered all these fc´s there. This doesn't happen with the type two antibodies and that's why you have less compliment dependent cytotoxicity for the type two. But in contrast by binding with the two arms within a single CD 20 tetramer we have been able to observe also by cryo-electron tomography that intracellular domains or CD 20 molecules then clustered together. And this leads to signalling, which we still don't fully understand. But it leads to the changes that I will explain in a second, at least some parts of the pathway that leads to this enhanced direct cell death. This non-apoptotic form of cell death. I will not go into details. We´ve already mentioned that one thing was published and discovered by the group of Martin Glennie in Southampton. It was that if you have higher levels in your B cells, it happens sometimes in CLL for example, higher levels of fc gamma r2b, then the type one antibodies over time can lead to a loss of the CD 20 molecule from the cell's surface of the antibody with it. But this doesn't happen to the type two. Also is important and I will explain you why later that when we modify the sugars of Gazyva in the fc region, we affected the binding as I told you the beginning fc gamma r3 receptor, the activating receptor. But we don't affect the binding to the fc gama r2b is quite selective, the technology in that respect. Which also therefore doesn't increase the downmodulation rate. So how come we can bind, what determines that the molecule can approach the CD 20 tetramer in this special way with the both arms let´s say like this. One thing is the angle at which it approaches the epitop. And here you have the crystalic structure of the cyclic peptide with the sequence of the extracellular loop of CD 20. This is Mabthera binding to it and Gazyva binding to it. So you can see as I said the epitopes overlaped but they are not identical, it approaches the molecule from a different angle. And then the other thing that we found was that during the humanisation of the parental antibody that led to Gazyva, that antibody was called actually Bly1 - and during that humanisation of this antibody we created many different variants, with tested many different variants. And because we were looking for a very good type two antibody we screened all these variants in an assay which is typical property of type two antibodies which is the direct cell death. So basically you you just take lymfoma cell - in this case it was a mantle cell lymfoma cell line - and you just put the antibodies and you look at the induction of direct cell death without any complement without any ADCC. And you can see that Gazyva is much better at inducing this direct cell death in this assay. Here is the positive control. However, when we then look at all these variants that we had made of Gazyva during the humanisation, we saw that some induced had this enhanced type 2 character, enhanced direct cell death induction, but others did no. Others look more like Mabthera in this assay. And when we look at what were the differences we were able to define that a single residue in what is called the elbow hinge - is not the typical hinge, you talk about the antibody that is here, right, between the Fc and the Fabs. It is the hinge that is within the Fab arm, the elbow hinge, that regulates also the flexibility of the Fab arms. And just by changing this residuum to the original residuum in the parental antibody you lose a lot of the type two character of Gazyva. Actually it's interesting that now it starts behaving a little bit more like a type one antibody, you can feed more of it in the surface, it starts getting more complement dependent cytotoxicity. So at least in the case of Gazyva, both the angle and the flexibility of the arms dictate that it can bind in type two mode. This direct cell death induction that was done with one cell, initially when we did the screening of the variants and we chose the Gazyva final variant. But then of course we tested in many different lymfoma cell lines, you can see here across the range, Gazyva you have in grey, Mabthera in blue and non treated in red. And you can see across the board we saw this enhanced direct cell death mechanism. It's not apoptotic, I´v already mentioned. And we have worked with several investigators. Here is the summary, it was published by the group in th UK, where some of the steps that are required for this mode of direct cell death induction have been identified. As i said, from clustering the intracellular domains of CD 20 to the first part that we see which is this reorganisation of the actin cytoskeleton and the homotypic adhesion. We don't know what is happening there but we know that this has to happen if you inhibit with inhibitors of actin polymerisation the cells, then you don't get the direct cell death. Then you have lysozomal permeabilisation, release of cathepsin. You get the production of reactive oxygen auspicious which requires NADPH oxidase, you can block it with inhibitors of NADPH oxidase. And then it leads to this non apoptotic cell death. To show how this looks life let's say in the laboratory here is a short very short movie where we have taken a mantle cell lymfoma cell line in four different dishes and we have thrown the antibodies. So here just the control. Here two type one antibodies, Mabthera and ofatumumab. And here Gazyva. And then we added with a green fluorescent label anexin 5 so when the cell's membrane starts to be disrupted the fosfatidylserin and anexin 5 can bind. And when the cells are really cruelly damaged, then we also have in red-orange the propidiumiodide which can penetrate into the cells and fix in the nucleus. So as the cells are being killed you should see them becoming green outside and then eventually read inside. It was all done at the same time and filmed in the microscope and accelerated here in a few seconds. So you can see that this first mechanism has quite an impact in differentiation between the type one antibodies and the type 2 antibodies like Gazyva. Now to the Fc engineering part. For the Fc engineering part you have - what we have done is modifying the suger structure. I will not go into the details but the most important part of the modification of the sugars is that the fucose residue is removed. When you don't have the fucose residue in this sugar, this is the structure of the FC of the antibody. here is in the two halfs, the red and blue in complex wit the FC gama r3 receptor. Here is the fucose residue. When you remove the fucose residue you allow - the sugar from the receptor site, that sugar that is found in interface with the receptor - you allow this to make additional contacts. We determined by mitogenesis and binding the studies and later we confirmed by actually solving the 3D crystal structure of the complex. And this is important that it requires the sugar from the receptor because only the activating Fc gamma r3 receptor, not inhibitoring one, has a sugar in that place. Otherwise that interface is quite conserve across Fc gamma receptors. And that's why the removing the fucose from the antibody increases the affinity only for the activating Fc gamma r3 receptor and not to the other receptors. And as i said we've confirmed that model by solving the crystal structure. This translates into enhanced ADCC, here shown in vitro and compared to ofatumumab and to Mabthera, both the potency and the efficacy are significant increase in the ADCC. Not only the ADCC is increased but the FC gamma r3 receptor is also present in monocytes, macrophages and neutrophils. And neutrophils in Fc gamma r3b form. And this leeds to several enhance properties. So in the case of monocytes and macrophages it leads to both enhanced ADCC. But also ADCP so enhanced antibody dependent cellular phagocytosis. In the case of neutrophils it leeds to enhanced activation and enhanced phagocytosis as well. Not ADCC in the case of the neutrophils. Remember the Fc gamma r3b does not have a direct signalling domain, is the GPI anchor protein. But it does surface and anchor and it leads to enhanced ADCP. And also we have shown that the enhancement of ADCC is so strong that it overwrites the inhibition of a target cells for example in CLL having multiple ligands for the killer inhibitor receptor of NK cells. When you take all the mechanisms of action together so enhanced ADCC, enhanced ADCP, NK cells, monocytes, macrophages, neutrophils, enhanced direct cell death, but reduced compliment dependent cytotoxicity - so you want to see how the whole thing works together in a single assay. So we did that using whole blood from CLL patients. This was a collaboration with Lark Ysebaert And we have done this also with other investigators and have polished that data as well. Here you see this summary where you have about one hundred patients classified according to the different genetic abnormalities. And across the board when you look at total B cell depletion in the whole blood, you have much better B cell depletion with Gazyva as compared to Mabthera. That was in vitro and how does it look in vivo. This is a model of aggressive lymfoma in mice where we have implanted the human xenograft tumour. And here is the growth of the tumour just for the weight for treated animals. If you give Mabthera, in grey here, at 1, 10 or 30 mg per kg - you can slow the growth of the tumour but already saturates at this point, between 10 and 30 mg per kg. You cannot get more efficacy in this model by giving more Mabthera. Whereas with Gazyva you can go from 1, to 10 to 30 mg per kg and particularly here at the higher doses you can really regress the tumours and actually eradicate them in this model. So just to summarise - we have generated an antibody that binds to CD 20 in a different way. It´s called the type two binding mode or type two anti CD antibody. As a result of that it has increased direct cell death. Also induces immunogenic cell death that primes the antigen presenting cells better than the type one. It has reduced CD 20 internalisation and loss of CD 20 and the antibody from the surface as compared to type one antibodies. And also has low or reduced compliment dependent cytotoxicity as compared to type one antibodies. This is the part that comes from being the type two. From the glycoengineered FC we have higher affinity to the FC gamma r3 receptors, we have enhanced ADCC by NK cells, macrophages and monocytes. We have enhanced ADCP - phagocytosis by enhanced binding to macrophages, monocytes and neutrophils. And we have reduced impact from the killer inhibitor receptors. And until then we have two main modes of action for differentiation. One is because of the type two antibody increased direct cell death and the other one because it's a glycoengineered antibody enhanced imuneffector functions, ADCC and ADCP. So let´s have a question just to make sure that I didn't put you to sleep. What type of antibody is Gazyva? You can read the possible answers there. Type one anti CD antibody with increased direct cell death and glycoengineered for enhanced ADCC, type two anti CD antibody with decreased direct cell death and glycoengineered for reduced ADCC or type two anti CD antibody with increased direct cell death and glycoengineered for enhanced ADCC. So please answer. Okay. Good. Thank you. Before handing to Guillaume I just want to thank - there was a huge team behind the discovery and development and of course all the investigators, all of you who have help us and the patients and their families. Thank you.

Podcast

Přehrajte si zvukovou stopu videa:

Podívejte se i na další přednášky webcastu Posouvání hranic v léčbě chronické lymfocytární leukémie.

Související články

Jak jednat u obtížně léčitelné CLL? Kdo jsou „obtížně léčitelní pacienti“ a jaké jsou dostupné možnosti, které máme v jejich léčbě? Navzdory zásadním pokrokům, ke kterým došlo v léčbě CLL, stále máme pacienty, kteří neprofitují ze standardní prvoliniové chemoimunoterapie.

Mezinárodní sympózium o novince v léčbě CLL otevřel  prof. MUDr. Marek Trněný, CSc., přednosta 1. interní kliniky hematologie a 1.LF UK Všeobecné fakultní nemocnice Praha. 

Přednášející vypráví příběh o vývoji obinutuzumabu, jehož začátek se datuje zpět do roku 2007.