Metody testování BRAF mutace

Metody testování BRAF mutace

Protože pouze pacienti s mutací BRAF V600 mohou mít prospěch z léčby BRAF V600 inhibitory, je třeba testováním BRAF mutace zjistit, kteří pacienti by měli být léčeni.

Existuje několik různých analytických metod pro stanovení BRAF mutace.

Mezi ně patří:

  • Přímé sekvenování
  • Analýza tání při vysokém rozlišení (HRM), ověřena přímým sekvenováním
  • Pyrosekvenování
  • Single-Strand analýza konformace polymorfismu
  • polymerázové řetězové reakce (PCR)

Přímé sekvenování DNA je jedním z nejvíce používaných metod pro analýzu DNA a bývá používána také k detekci BRAF mutací. Je to vysoce specifická technika, ale méně citlivá než některé real-time PCR techniky. Omezení citlivosti může vést k falešným negativitám (mutace nejsou detekovány). Rozdíly v citlivosti mohou vysvětlit velké rozdíly ve frekvencích mutací BRAF hlášených v literatuře. Riziko falešné negativity má za následek, že pacient nesplňuje podmínky pro léčbu a nedostane ji.

Přímé sekvenování vyžaduje na provedení také značné množství času (7-10 dní v průměru).
Tyto nedostatky vedly k použití metod založených na PCR, které jsou více citlivé, snadno automatizované a vhodné pro vysoké počty diagnostických testů. Na trhu se začínají objevovat komerčně dostupné PCR testovací soupravy pro BRAF mutaci. V současné době neexistuje shoda, pokud jde o optimální metodu pro detekci mutací BRAF v klinických vzorcích.

COBAS ®4800 V600 BRAF mutační test byl navržen tak, aby detekoval přítomnost mutace V600 v genu BRAF v DNA extrahované z FFPE (formalinem fixované parafinem obalené) lidské melanomové tkáně. Jako takový je určen k použití pro výběr pacientů pro léčbu vemurafenibem - inhibitorem BRAF (Zelboraf Roche).

Test se provádí v molekulární laboratoři na DNA extrahované z FFPET vzorků maligní tkáně. To vyžaduje 2 x 5 um řez tkáně z FFPET bloku namontovaný na sklíčcích. Jeden řez je obarven hematoxylinem a eosin k posouzení, zda řez obsahuje dostatek nádoru pro provedení testu.
Druhý řez se používá pro PCR. DNA je izolována z tkáňového řezu pomocí cobas ® DNA izolační soupravy speciálně vyvinuté pro tento a další dva onkologické prediktivní testy (cobas KRAS a cobas EGFR mutační testy). Činidla pro PCR jsou obsaženy v COBAS ® 4800 V600 BRAF testovací soupravě. PCR amplifikace cílové DNA používá vzájemně se doplňující dva páry primerů oligonukleotidové sondy označené fluorescenčním barvivem. Jedna sonda je určen k detekci divokého typu BRAF a druhá sonda je určen k detekci mutace BRAF V600.

cobas ® 4800 V600 BRAF mutace test - srovnání s jinými metodami

Competitive landscape

cobas ® 4800 BRAF V600 Mutation test – comparison to other methods

Feature cobas® BRAF test1 therascreen
BRAF RGQ2 kit
Direct
sequencing
Next generation
sequencing
PCR-based LDT
% tumor
required
≥50% undefined Undefined Undefined Undefined
DNA input
required
125 ng/25µl requires PCR titration Undefined Undefined Undefined
Sensitivity < 5% FFPET 1-5% in cell line ~20% ~1%-5% Undefined
Storage
Conditions
2° - 8 ° C -18° to -25 ° C Variable Variable Variable
Control/Result
Interpretation
Automated Manual Manual Manual Manual
Workflow <8 hours ~16 hours ~ 3 days ~ 5 days ~ 16 hours
IVD platform CE-IVD, FDA
approved
RUO RUO RUO RUO

1 Cobas ® 4800 BRAF V600 Mutation test CE-IVD Package insert Roche Molecular Systems Inc USA 2011;
2 therascreen BRAF RGQ kit CE-IVD Handbook Qiagen Manchester Ltd, UK 2011.
LDT Laboratory-developed test

COBAS ® 4800 V600 BRAF mutační test vykazuje zlepšení ve srovnání s jinými metodami.

  • Je definována kvalita a množství výchozího materiálu.
  • Byly provedeny studie pro definování citlivosti COBAS ® 4800 BRAF V600 mutačního testu na FFPET vzorcích, tj. tkáně, pro které je určen. Nedávno publikované údaje dokazují, že PCR cobas BRAF mutační test je citlivější než Sanger sekvenování při rozhodování, který pacienti budou mít prospěch z protimelanomového léku Zelboraf , což by mohlo přesvědčit laboratoře, aby nahradily jejich standardní laboratorní metody za FDA schválené testy v souvislosti s léčbou. Nová data se objevila jen něco málo přes měsíc poté, co FDA schválila Roche / Plexxikon Zelboraf (vemurafenib) a související BRAF diagnostiku poté, co klinické studie prokázaly, že lék výrazně prodlužuje přežití pacientů s metastazujícím melanomem obsahujícím BRAF V600E mutaci (PGX Reporter 8/17/2011). V FDA-schválené charakteristice Zelborafu se uvádí, že lék je určen "k léčbě pacientů s neresekovatelným nebo metastazujícím melanomem s BRAFV600E mutací detekovanou FDA-schváleným testem. "Roche cobas test není jmenovitě uveden, ale je to v současné době jediný test, který agentura schválila pro použití v souvislosti s léčbou Zelborafem.
  • Činidla nevyžadují skladování při teplotě nižší než 0 ° C, což snižuje nestabilitu činidel způsobenou cykly zmražování / tání a snižuje potenciální plýtvání.
  • Potenciální subjektivita interpretace výsledků u jiných vyšetřovacích metod, jako je Sangerovo sekvenování, je eliminována automatizovaným hlášením výsledků u testu cobas.
  • COBAS ® BRAF test byl použit v klinických studiích pro vemurafenib a pro výběr pacientů, jejichž nádory obsahovaly mutace V600 v genu BRAF a je jediným klinicky validovaným testem
  • V preklinických a klinických zkoušeních měl test COBAS ® BRAF > 99% přesnost v detekci mutace BRAF V600E (1799 T>), což představuje > ~ 85% všech mutací BRAF hlášených v COSMIC databáze.
  • COBAS ® BRAF test je více citlivý a specifický při detekci V600E mutace než Sangerovo sekvenování.
  • Ve formalínu fixované, parafínem obalené tkáni (FFPE), test cobas ® BRAF může objevit V600E mutaci na úrovni lepší než 5%.
  • Test je také citlivý na jiné V600 mutace, jako V600D a V600K, kdy zejména mutace V600K v klinických studií dobře odpovídala na léčbu Zelborafem.
  • COBAS ® BRAF test má nízkou míru selhání a je vysoce reprodukovatelný mezi laboratořemi, operátory, šaržemi reagencií a testovacími dny.
  • COBAS ® BRAF test může být proveden za <8 hodin od obdržení vzorku, což znamená, že výsledky mohou být získány v jedné pracovní směně.

Související články

Pokročilý maligní melanom stále patří k diagnózám s velmi vážnou prognózou a omezenými léčebnými možnostmi. Intenzivní výzkum umožnil vývoj nových léků z oblasti imunoterapie a cílené léčby. Vemurafenib a ipilimumab se stávají novým standardem v léčbě pacientů s pokročilým melanomem. 

Prognóza maligního melanomu stadia IV je velmi špatná. Přežití se pohybuje v měsících od stanovení diagnózy metastatického onemocnění. Doposud nebyla žádná z používaných paliativních chemoterapeutik ani imunoterapeutik účinná u disseminovaného onemocnění maligním melanomem. Nyní se ukazuje nový možný léčebný přístup, jednak imunoterapie, léčba cílená na hostitele, a jednak terapie cílená na nádor, léčba vemurafenibem, která přináší velmi pozitivní výsledky v podobě kompletní i parciální odpovědi na léčbu.

Přednáška odezněla v rámci bloku Systémová protinádorová léčba (Melanom, HNC, NSCLC, sarkomy) na Brněnských onkologických dnech v roce 2015.