Determination of vitamin D status in different patient populations: challenges and solutions

Přednáška uvádí do problematiky vitaminu D a jeho testování v těhotenství. Připravujeme české titulky. 

TIP: Pro lepší zážitek zvolte režim "Celá obrazovka" (ikonka vpravo dole na liště)

Video

Textový přepis

Tip: Kliknutím na místo v textu, přetočíte přehrávané video.

Dobrý den, je mi ctí přednášet vám dnes o výzvách, které stále v testování vitaminu D jsou, ačkoli je to nyní už rutinní metoda, a o řešeních, která můžeme nabídnout. Takže o čem budeme hovořit? Dáme si krátký úvod k zhodnocení statu vitaminu D, kde vám nejprve ze všeho ukážu, jaký marker by měl být testován, jaká populace by měla být testována a kdy. A pak se podrobně podíváme na ty výzvy. Zde se zaměřím specificky na standardizaci, na metabolity a na možnou interferenci vázajících proteinů, a rozdíly v matrix. Pak si z toho řekneme nějaké závěry. Když hovoříme o vitaminu D jako takovém, vitamin D, jak víte, není ve skutečnosti tak úplně vitamín, ale spíše hormon. Do těla se dostává trávicím traktem jídlem, či v suplementech, jako jsou kapslové vitaminy, ale ve skutečnosti si ho tělo také umí samo vytvořit, a to v kůži, po expozici slunečnímu svitu - UVB. To je také důvod, proč je i hormon. Sluneční svit vyvolává syntézu vitaminu D – formy D3, cholekaciferolu, zatímco příjmem v potravě či suplementech může tělo získat obě formy – D3 i D2, což je ergokalciferol. Jak dochází v těle k metabolizaci? K prvnímu kroku dochází v játrech. Játra hydroxylují vitamin D na pozici 25 na zásobní formu – 25-hydroxy-vitamin D. A to je ve skutečnosti ta molekula, kterou bychom měli měřit, chceme-li stanovovat status vitaminu D. Jelikože se jedná o zásobní formu, je stabilní, vydrží až 3 týdny, a bude konvertována na aktivní formu, což je 1,25-dihydroxy forma vitaminu, pouze v případě, že to tělo potřebuje. Oproti tomu tato forma, molekula 1,25 má velmi krátkou životnost – 3-4 hodiny a v cirkulaci se vyskytuje na velmi nízkých hladinách, v pikogramech na ml, zatímco forma 25 v hladinách nanogramů na ml, čili je snáze detekovatelná a poskytuje nám představu o rezervách organismu k produkci aktivní formy 1,25, když je potřeba. A aktivní forma je ta, která působí v těch stěžejních orgánech, jak je ukázáno zde – kosti, příštítná tělíska a střevo, tak aby vskutku regulovala metabolismus vápníku spolu s PTH. Tento děj v kostech vede k resorpci kalcia, k udržení homeostázy. Ve střevech má za úkol absorpci kalcia z potravy. A působí také zpětnovazebnou kličkou na příštítná tělíska a suprimuje sekreci parathormonu. Ráda bych ještě zdůraznila jednu věc. Že molekula vitaminu D a i všechny jeho metabolity jsou velmi hydrofobní. Proto potřebují vazebné proteiny, aby byly schopné cirkulovat v hydrofilním prostředí. V průběhu prezentace se ještě dostaneme k tomu, jak důležité tyto vazebné proteiny jsou. Ještě zastavení k tomu, kdy měřit 1,25 formu a 25 formu vitaminu D. U statu vitaminu D je již dlouho známo, že forma 25 hydroxy by měla být měřena. Zde bych citovala dva odborníky na vitamin D – profesor Hollis a profesor Thadani, kteří poukazují na kdy a zda má smysl měřit formu 1,25 vitaminu D. Profesor Hollis říká, že smysl to má u některých velmi vzácných chorob, a to hlavně rachitis závislá na vitaminu D2, a granulomatózních onemocnění, z nichž nejčastější je sarkoidóza. Proto chceme-li mít představu o tom, jaký objem těchto vyžádaných vyšetření zde bude na základě klinicky relevantních požadavků, je jasné, že bude odpovídat incidenci sarkoidózy - 14 na 100 000. V reálu však řada kliniků je zmatena, když mají testovacím panelu obě varianty – 25 a 1, 25 a zaškrtnou 25 i 1, 25. Ačkoli měřena by měla být forma 25, pokud nemají podezření na některou z těch velmi vzácných chorob. Tolik k tomu, co říká první odstavec. Druhý odstavec je od významného nefrologa z Harvardu, který zde přináší doporučené postupy z Harvardu, které jsou v souladu s guidelines pro nefrology. Poukázal na to, že existuje určitý chybný koncept toho, jak vnímají nefrologové 1, 25 formu pro testování vitaminu D u chronických onemocnění ledvin. Guidelines jasně hovoří proti testování 1,25 formy. Říkají, že pouze v případě, kdy je hyperkalcémie spojena s nízkou hladinou PTH dává smysl zadávat další vyšetření a testovat také formu 1,25. Ale v jiných případech, řekněme při normálním vyšetření minerálového metabolismu, by nefrologové měli používat běžnou formu, čili PTH, kalcium a 25-hydroxyvitamin. Dokonce i v případě, že pacientovi podávají aktivní formu vitaminu D, stanovení hodnoty 1, 25 nedává smysl. Měla by se měřit hladina vápníku, protože to, čeho se obávají, navození hyperkalcémie podáváním aktivního vitaminu D. Myslím, že teď už je jasné, že 25 – hydroxycholekalciferol je ta forma, na kterou se zaměřujeme při hodnocení statu vitaminu D. Teď si shrneme, u jaké populace by toto mělo být testováno, na základě expertních názorů a guidelines klinické společnosti. Tato tabulka nám sumarizuje daná doporučení od různých expertů. V zásadě doporučuje, aby byli testováni pacienti, kteří jsou ve větším riziku deficitu vitaminu D. Můžeme je rozdělit do tří hlavních skupin. Pacienti, kteří jsou ohroženi ztrátou kostní hmoty – pacienti s, nebo v riziku osteoporózy, hyperparathyreoidismus s osteomalacií, pacienti v riziku vzniku fraktur a pádů, také pacienti, kteří mají nízkou endogenní produkci vitaminu D, protože nejsou exponováni slunečnímu svitu – jako například dlouhodobě hospitalizovaní pacienti, kteří tráví většinu času na lůžku, nebo také pacienti s tmavou pletí, nebo zahalené ženy, které nikdy neexponují svou kůži slunci. Dále jsou tu pacienti s abnormálním metabolismem či katabolismem vitaminu D v důsledku například obezity či malabsorpčních syndromů nebo například ve stavech jako je těhotenství nebo například chronické onemocnění ledvin. Všichni tito pacienti jsou ve větším riziku deficitu vitaminu D a je doporučeno je testovat v úvodu, a pak tři měsíce po zahájení suplementace, abychom zkontrolovali, že dosáhli optimální hladiny. Nyní otázka stojí tak, co je tou optimální hladinou? To je stále trochu otevřenou otázkou, čímž chci říci, že nebylo dosaženo úplného konsenzu. Existují dva odlišné názory, tak, jak je máte uvedeny zde. Endokrinologická společnost a Mezinárodní společnost pro léčbu osteoporózy (IOF) považují cut-off 30 ng/ml jako suficientní hladinu vitaminu D u pacientů, zatímco Institut medicíny se zaměřuje více na obecnou populaci, řekněme více zdravé probandy, a považuje za dostatečnou hladinu 20 ng/ml. Nicméně, není tak důležité, co si váš lékař vybere, důležité je testovat v úvodu a po třech měsících. Protože každý z nás zareaguje na suplementaci odlišně, z rozličných důvodů. V zásadě, pokud bychom všichni užívali stejnou dávku vitaminu D, jak poukazuje tady tato studie – například 1000 mezinárodních jednotek za den, naše hladiny se od té úvodní mohou velmi lišit. Některým pacientům vzrostou hladiny jen na 5-10 ng/ml, některým hladiny vzrostou až na 30 ng/ml, v průběhu stejného časového období, za 6 měsíců užívání 1000 jednotek za den. V zásadě není možné odpověď predikovat, a proto je třeba testovat. Je tomu tak v důsledku řady faktorů, které máme tady vyjmenované, od typu suplementace, jaká je podávána – D2 nebo D3, dávkování – je-li denní, týdenní, či roční dávkování, také kvůli vstupní hladině – čím nižší je vstupní hladina, tím větší může být její nárůst, ale jak už jsme řekli, hrají roli i metabolické faktory, jste-li těhotná, nebo máte vysoké BMI, nebo pokud užíváte nějakou medikaci, která může interferovat. S ohledem na výše řečené je jasné, že jediným způsobem jak zjistit status vitaminu D, je opravdu to změřit. Nyní se dostáváme k těm výzvám, kterým vy čelíte každý den, a jak vám můžeme pomoci je překonat. Nejprve bych ráda hovořila o standardizaci. Jak víte, v literatuře najdete mnoho k těmto rozborům, assay nabízející různé hodnoty u úplně stejných pacientů. Je tomu tak proto, že dlouhou dobu nebyla žádná referenční metoda ani referenční materiál, takže detekční metody byly standardizovány různými způsoby. V USA byla zahájena iniciativa NIH a NIST, CDC a jiné mezinárodní společnosti jako IFCC a IACC a DEQAS pro standardizaci rozboru statu vitaminu D. Prvním aspektem bylo dostat referenční materiál. Ten vydal NIST, v úvodu pro použití hlavně chromatografickými metodami, potom sérové materiály. Pak zde bylo zavedení oficiální metody měření. Nyní to jsou dvě: tekutá chromatografie tandem-mass spektrometrie (LC-MS/MS). Jedna v USA od NIST a jedna v Evropě od Ghent, obě jsou uznávané, uvedené na seznamu GCTLM jako oficiální referenční metody pro měření 25-hydroxyvitaminu D. S těmito nástroji byl vytvořen tlak na výrobce, ale také na laboratoře srovnat své lokální metody s těmito referenčními materiály. CDC zahájilo program, který umožnil výrobcům i laboratořím srovnat, jak blízko jsou jejich metody s metodami referenčními, a také pokud bylo třeba, se přizpůsobit standardizaci. Pokud metoda byla v souladu s referenční metodou, byl jí poskytnut standardizační certifikát. Jak vidíte zde. To je certifikát, který jsme získali pro Elecsys Vitamin D Total Assay. V zásadě lze říci, že metoda bude certifikována, pokud obstojí ve dvou zásadních kritériích: první z nich je bias a druhá je přesnost. Bias musí být v mezi 5% od referenční metody. A přesnost – nebo lépe – nepřesnosti se musí pohybovat v mezích 10%. Odpovídají-li obě tyto hodnoty, CDC vydá certifikát s touto poznámkou: je zodpovědností každého účastníka zajistit, že výsledky jeho vyšetření zůstanou i v čase a po mnoha vyšetřeních konzistentní. Protože samozřejmě oni vidí výsledky jednoho vyšetření a musí se ujistit, že tato kvalita bude i v průběhu času udržována. A to už je zodpovědnost výrobce. Na dalším slidu bych vám ráda ukázala, jak jsme dokázali, že naše metoda udrží kvalitu shodnou se správnou standardizací mezi jednotlivými vyšetřeními. Wielders a kolektiv v multicentrickém hodnocení studoval vyšetření od vyšetření, s různými reagenciemi Elecsys Vitamin D Total Assay na dvou typech séra, které získali z vlastních pacientských vzorků. Jeden s velmi nízkými hladinami vitaminu, ekvivalentní s 8 ng/ml, druhý na středních hladinách. Můžete zde vidět vyznačena jednotlivá měření, s různými reagenciemi, v průběhu 13 měsíců. Koeficient variace pro tato séra byl spočten, poté co byla zpětně odebrána, a bylo shledáno, že konzistence mezi jednotlivými vyšetřeními je velmi dobrá. Což znamená, že můžeme věřit tomu, že assay je opravdu robustní, a můžeme si být jisti, že monitorování pacientů prostřednictvím této assay nám dává smysluplné výsledky a že variabilita, kterou vidíme je na vrub změny v suplementaci a ne variabilitou assay. Dalším způsobem, jak se podívat na to, jak je tato shoda s referenční metodou v průběhu času udržována, je DEQAS – externí zhodnocení kvality. V tomto případě autoři procházeli vzorky z října 2012, kdy DEQAS začal užívat cílové hodnoty v obdržených vzorcích z NIST LC/MS, čili uznávané referenční metody. Když se podíváme na zpětný odběr všech distribuovaných setů vzorků, distribuovaných DEQAS, můžeme monitorovat, zda naměřené hodnoty v zpětně odebraných vzorcích se blíží 100% a zda se drží ve stejném uspořádání jako referenční metoda. A zde jsou závěry, ke kterým došli, se spolehlivostí +/- 5%. Již jsme probrali standardizaci. Věřím, že je jasné, jak je důležité vybrat si metodu přesnou a shodnou s metodou referenční, a také tu, která je schopna tuto shodu udržet v delším časovém horizontu. Nyní se dostáváme ke druhé části, které je o vlivu vazebných proteinů v matrix séra na přesnost provedené assay. Vrátíme se zpět do roku 2012. Graham Carter, což je organizátor DEQAS, uvedl v této publikaci, že 25-hydroxyvitamin je skutečně obtížný k analýze. A uvedl právě, že jedním z kritických kroků, je uvolnění z vazby vazebného proteinu. Již jsem zmínila, že molekula je velmi hydrofobní a musí proto být navázána na vazebný protein, aby byla schopna cirkulovat. Prvním krokem jakéhokoliv rozboru vitaminu D je rozvolnění analytu, který chcete měřit, z vazby vazebného proteinu, ať už ho chcete pouze separovat, nebo denaturovat, tak aby nedocházelo ke zpětné asociaci v průběhu další reakce, ve zbývajících krocích. Až do roku 2012 nebylo žádného důkazu o tom, že by bylo možné 100% molekul disociovat. Nizozemská skupina byla první, kdo provedl takovouto studii, kdy sledovali, jak hladina vazebného proteinu může ovlivnit přesnost rozborů vitaminu D. Aby toto mohli studovat, porovnávali skupinu zdravých probandů, normální populaci, kde se předpokládá normální hladina vazebného proteinu, s populací s vyšší hladinou vazebného proteinu, což je populace těhotných žen, a dále populaci s nižší než normální hladinou vazebného proteinu, což jsou pacienti na JIP. Prováděli komerčně dostupné assay, a sledovali jejich přesnost v populaci těchto pacientů, a porovnávali s LC/MS, která je brána jako referenční. Na tomto slidu vidíme první čtyři automatizované assay, Liaison, Centaur, iSYS a Architect. Na dalším slidu je Elecsys od Roche a RIA. A jak je vyznačeno zde, dochází k signifikantním deviacím od výsledků LC/MS. V sloupcích vidíme deviace výraznější než 1, a deviace v interceptu lišící se od 0. Autoři uvádí tyto problémy v měření v pacientské populaci s vyšší či nižší hladinou vazebného proteinu u některých analytických metod, jak vidíte. V populaci JIP pacientů, kteří mají nejnižší hladinu vitamin D vázajícího proteinu, pozorovali, že 20% těchto pacientů bylo suficientní v LC-MS/MS. Zatímco LIAISON považoval za vitamin D suficientní – 52%. Pokud více pacientů vyhodnotíme jako suficientní, je jasné, že nedostanou suplementaci vitaminu D, i přesto, že by léčbu potřebovali, ji nedostanou. Na druhé straně máme populaci těhotných žen, u kterých je hladina vitamin D vázajícího proteinu vyšší než norma a velké množství z nich bylo LC-MS/MS vyhodnoceno jako suficientní, ale méně než polovinu z nich Centaur a iSYS vyhodnotily jako suficientní. Takže v tomto případě více pacientek dostane vitamin D suplementaci, i když ji nepotřebuje. Jediné dvě metody, u kterých nebyla zaznamenána závislost na hladině vazebného proteinu, jsou Elecsys a RIA. U RIA to může být snadno vysvětleno, jelikož prvním krokem analýza je separace z vazby vazebného proteinu. Ale všechny automatizované assay mají automatizované i přípravné kroky. Takže zjevně přípravné kroky u Elecsys jsou efektivnější, než u ostatních automatizovaných assay ve smyslu rozvolnění vazby vazebného proteinu efektivním způsobem, a proto se zde nejeví závislost na hladině vazebného proteinu. U celé populace byly výsledky ve shodě s LC/MS metodou. Vysvětlení toho, proč se takto chová většina automatizovaných assay kromě Elecsys, je, že zjevně hladina vazebného proteinu vliv má proto, že ne všechny molekuly vitaminu jsou uvolněny z vazby, a proto tato hladina interferuje s výsledky a podhodnocuje hladinu vitaminu D. Velmi podobná studie byla provedena u hemodialyzovaných pacientů. Tady byly porovnávány pouze 3 metody – Architect, Elecsys a iSYS. A každá z nich byla opět srovnávána s LS/MC, jakožto referenční metodou. Opět byla provedena analýza korelace s referenční metodou. Elecsys a iSYS měly korelaci velmi dobrou, jak u zdravých probandů, tak u dialyzovaných pacientů, s tím, že Elecsys se držela v užší shodě s referenční metodou, ve sloupcích blíže 1, v porovnání s LS/MC metodou. Na druhé straně, zde byl problém s metodou Architect u dialyzovaných pacientů. Byli pak chybně klasifikováni, až 50% dialyzovaných pacientů bylo zhodnoceno jako insuficientní. Výsledky této metody by mohly vzbudit obavy a vést k další suplementaci, ačkoli není potřebná. Vysvětluje se to tak, že ačkoli hladina vazebného proteinu zde je stejná jako u zdravých kontrol, ale matrix je uremická, má vysokou koncentraci urey, která může interferovat s uvolňováním analytu z vazby vazebného proteinu. Třetí faktor, na který bych se ráda zaměřila, jsou metabolity, a zvláště C3-epimer. Víme, že tento epimer vzniká v průběhu metabolizace, která probíhá na pozici 3. Bylo známo, že se vyskytuje u novorozenců. Ve skutečnosti u nich může dosahovat až 50% celkové hladiny vitaminu D. V roce 2012 se objevují první data o C3-epimeru v séru dospělých. Takto byly popsány koncentrace a distribuce. Můžete zde vidět, že většina dospělých, 92% z nich, má v séru přítomnu hladinu epimeru C3 méně než 3 ng/ml. Čili opravdu nízké. Ale můžeme říci, že je zde zkřížená reaktivita C3 epimeru, která hraje svou roli, hlavně u novorozenců. Na balení od výrobce se proto k tomuto vztahuje prohlášení, že dochází ke zkřížené aktivitě s C3 epimerem. Nyní se vám pokusím vysvětlit, jaké to udělá rozdíly, pokud dojde k prudkému vzrůstu, nebo pokud máte přirozený obsah C3 epimeru v séru. Všichni výrobci musí provádět testy na zkřížené reakce C3 epimeru v různých koncentracích, na řekněme normálních sérech. Jak jsme viděli, v sérech dospělých pacientů jsou velmi nízké koncentrace C3 epimeru a přístup k novorozencům úplně nemáme. Nevím, kolik z vás testuje séra novorozenců ve své rutinní praxi. Ale přístup k těmto vzorkům je velmi vzácný. Proto tato testování děláme analýzou prudkého vzestupu C3 epimeru v matrix. Nicméně, tato pracovní skupina Van den Ouwelanda z Nizozemska měla přístup ke kohortě novorozenců s přirozeně vysokou hladinou C3 epimeru – představoval až 58% celkového D, čili opravdu vysoká koncentrace. A dělali srovnání s LC/MS a vyvinuli tak metodu, jak separovat C 3 epimer od zbytku vitaminu D a byli tak schopni kvantifikovat oba. To, co očekávali, na základě varování od výrobce, byla diskrepance mezi výsledky LC/MS a naší assay. Ale ve skutečnosti byli velmi mile překvapeni, že Elecsys nehodnotil žádné C3 epimery. Na druhou stranu byli schopni tento experiment reprodukovat. Když dojde k prudkému zvýšení hladiny, dojde ke zkřížené reakci a zvýšení celkového obsahu. Ale když vezmete přirozené vzorky, toto se neobjeví. Nyní se dostáváme k závěru. Chtěla bych jen vyzdvihnout některé body. Myslím, že po tom co bylo řečeno je jasné, jak je důležité, aby si laboratoř vybrala metodu, kterou chce používat, na základě cut-off, ale také na základě toho, jaká bude pacientská populace, kterou ve své rutinní praxi očekávají. Standardizace analytické metody je velmi důležitá. Musí být udržitelná v delším časovém horizontu, konzistentní mezi jednotlivými vyšetřeními. A je důležité, pokud vyšetřujete těhotné nebo dialyzované pacienty ve své rutinní praxi, protože představují část populace, kde takové testování je indikované, je třeba vzít v potaz test, který neinterferuje s hladinou vazebného proteinu. Doufám, že jsem vám z literárních zdrojů poskytla dostatek důkazů, že Elecsys assay všechny tyto aspekty splňuje, co do spolehlivosti standardizace, konzistentnosti mezi jednotlivými vyšetřeními a přesnosti měření v mnoha pacientských populacích, včetně novorozenců s přirozeně vysokou hladinou C3 epimeru. Děkuji za pozornost.

Good morning, it's a pleasure to be here to talk about the challenges that vitamin D testing still poses, despite being now a routine test to describe a solution that we can offer. We will have a brief introduction about the vitamin D status assessment in which I will explain first of all which marker should be tested, which population should be tested and when. Then we'll go into the details of the challenges. Here I will focus specifically on standardization, on the metabolising and on the potential interference of binding proteins and difference upon matrix. Then we'll draw some conclusion. Talking about vitamin D itself, it's as you know actually not quite a vitamin, but a hormone, so it can be introduced in the body by digesting food or some supplments, like vitamins. It can also be produced by the body itselfy by the skin upon the exposure of some light - UVB. This is why it's also a hormone. The sunlight triggers the synthesis of vitamin D in the form of D3 or cholecalciferol, while through food or some supplementation you can have intake of both forms of D3 or D2 which is ergocalciferol. How does it get metabolised through the body? The first sted occurs in the liver. The liver hydroxilate the vitamin D in postition 25 to form the storage form, 25(OH)D This is actually the molecule that we should measure to assess the vitamin D status. Because it's a storage form and it has a long half-life of 2 to 3 weeks, it will be converted to the active hormone, which is the 1.25(OH)2D formed only when the body needs it. So the 1.25(OH)2D has a very short half-life of 3 to 4 hours and the circulating very low concentrations in the picogram to ml levels, while the 25 form is using the nanograms per ml, so it's more easily detectable and it gives you an idea of the reserve that we have to be able to produce the 1.25(OH)2D active form when it's needed. The active form is the one that acts on the main organs shown here: the bone, parathyroid glands and intestine to really regulate calcium metabolism together with PTH. This action in the bone results in the resorption of calcium to reestablish calcium homeostasis. In the intestine it results in the absorption of the calcium from the diet. It also acts with a feedback loop on the parathyroid gland to supress the secretion of parathyroid hormone. I just want to mention one thing that the molecule, the vitamin D and also all the metabolites are very hydrophobic. Therefore they need the binding protein to be able to circulate in a hydrophilic environment. We will come back to the importance of these binding proteins in the rest of the presentation. One more point about when to measure 25(OH)D and when to measure 1.25(OH)2D. For vitamin D status is quite well known for a long time that the 25(OH)D should be measured. Here I report quotes from two vitamin D experts, Prof. Hollis and Prof. Thadani, which indicate when or if it makes sense to measure 1.25(OH)2D. Prof. Hollis says that it does make sense in some very rare diseases, mainly Vitamin D dependent rachitis type 1 and 2 and granulomatous diseases, most common of which is sarcoidosis. Therefore if we want to have an idea of the volume of that requests that you should get based on these clinical relevant request, you should get about the same incidence as the incidence of sarcoidosis. So 40 cases per 100 000 of the population. In reality though some clinicians are confused and if they are given the option of 25 and 1.25 sometimes they cross both boxes so they request both erroneously, because in fact there's no reason to request 1.25, unless they have a suspicion or these very rare diseases. So that's what the first statement says. The second statement comes from a very important nephrologist from Harvard. He reports basically the practice in Harvard and also the practice according to the guidelines for nephrologists. So there is this misconception that nephrology requests 1.25 test for the chronic disease But in fact the guidelines are opposed to testing 1.25. They say that only in the cases in which there is a hypercalcemia associated with low PTH it makes sense to do further investigation and also test 1.25. But otherwise with the normal investigation of mineral metabolism nephrology should test the usual parameters of PTH, calcium and 25(OH)D. And even if they provide the active vitamin D as a drug to their patients, it doesn't make sense to test the 1.25 levels. They should rather test the calcium levels, because what they are afraid of is inducing hypercalcemia by giving the active vitamin D. U think it's clear from these the 25(OH)D molecule is the one that we are focusing on for assessment of vitamin D status. Now we will review in which population it should be tested based on the expert opinion and the guidance of clinical society. This table summarises recommendations from different experts. It basically recommendes that patients with higher risk for vitamin D deficiency should be tested. This could be a divided into three major groups. Patients who are at risk of bone loss, which could be patients with or at risk for osteoporosis with hyperparathyroidism and osteomalacia, patients who are at risk for fractures and falls, also patients that have low endogenous production of vitamin D because they are not exposed to sunlight like institutionalised patients, who spend most or all of their time in an institution in bed, most likely; and also people with dark skin, and for example veiled woman who never expose their skin to sunlight. Then there are some patients with abnormal metabolism or catabolism of vitamin D due to for example obesity or malabsorption syndroms or due to conditions like pregnancy or chronic kidney disease for example. All these patients are at high risk for vitamin D deficiency and it's recommended to test them at baseline and then after 3 months from the beginning of supplementation to make sure that they have reached the optimal levels. Now the question is what are the optimal levels? This is still an open question meaning that there is no consensus reached. There are 2 main opinions reported here: The Endocrine Society and the International Osteoporosis Foundation indicate a cut-off 30 ng/ml for vitamin D sufficiency in patient, while the Institut of Medicine focuses on the general population, that are apparently healthier subjects, and they indicate that having levels of 20 ng/ml is sufficient. But no matter what cut-off your clinicians use, what is important is that they understand the importance of having a baseline value and the value after 3 months. This is because each one of us responses differently to the supplementation due to a number of factors, and basically if we all take the same dosage of vitamin D as it is in these studies, e.g. 1000 international units per day, our values may raise from the baseline to very different extent. Some people would have from 0 to 5 ng/ml increase from the baseline, some people may have up to 30 ng/ml increase in the same amount of time, which is 6 months of having 1000 units per day. Basically you cannot predict the response and that's why it makes sense to test. This is due to a number of factors reported here which go from the type of the supplementation prodvided, D2 or D3, to the dosage, if it's daily, weekly or yearlong dose. It's also due to the baseline, so the lower is the baseline value, the higher is the increase. Also as we said the metabolic factors play important role, so if you're pregnant, if you have high BMI or if you take medications that may interefere. Having said that, we have seen when it makes sense to assess the vitamin D status. Now we go to challenges that you face every day and how we can help you overcome those. First we talk about standardization. You know that in the literature there are a lot of assays reporting different values for the very same patient. This is due to the fact that for a long time there was no reference method or reference material, so the assess were standardised in a different way. There were initiatives that started in the U.S.: NIH, NIST, CDC and also included other international societies like IFCC, IACC and DEQAS for standardizing vitamin D status, so basically adressing the very ability from assay to assay. First thing was to release a reference material. NIST released the reference material initially to be used mainly way to chromatographic methods. Then also serial based material. Then there was the establishment and the recognition of the official reference measurement procedures so now there are two: liquid chromatography tandem-mass spectrometry methods (LC-MS/MS). One is in the in the U.S. from NIST and one in Wurope from Ghent. They are officially recognised and listed by GCTLM, so officially recognised reference methods. for 25(OH)D measurement. Having these tools then there is a push for the manufacturers but also for the labs who have in-house development methods to aline these references methods and materials. CDC started a programme to be able to allow manufacturers and labs to test how close this method is to the references and also to adjust, if needed, the standardization. If the method is in line with the reference method, a certificate of the standardisation would provided. What it's shown here is a certificate that we obtained for the Elecsys Vitamin D Total Assay. Basically the certificate is obtained if the assay complies with 2 main criterias. The first one is a bias and the other one is precision. The bias has to be in within 5 % from the reference method. The precision or imprecision has to be less than 10 %. When both criteria are met the CDC releases the certification with a note. The note says that it is a responsibility of the participant to ensure that the results of the method remain consistent over time and between lots, because obviously they see a picture of one lot, but they need to make sure that the certification is maintained over time. That's the responsibility of the manufacturer. What I'm going to show you in the next slide is how we can prove that our method can maintain this traceability in the right standardization from lot a lot. Wielders and the others in the multicentric evaluation look at the consistency from lot to lot of multiple reagents Elecsys Vitamin D Total Assay and they tested 2 setum pools that they obtained at their own patients' samples. One of a very low level equivalent to 8 ng/ml and the other at medium levels. You can see from the symbols each test with various reagents over 13 months. He calculated the coefficient of variations for the recovery in the serum and concluded the consistency from lot to lot that is very good. This means that they can trust the robustness of the assay and they are sure that monitoring patients with these assays gives meaningful results, showing the actual variation due to the supplementation, not just the variability of the assay. Another way to look at how these alignment with the reference method is kept over time is to use the DEQAS: the external quality assessment scheme. In this case the authors look that samples from October 2012 when DEQAS started to use target values of the DEQAS samples obtained with NIST LC/MS, so the recognised reference method. Also in this way you can look at the recovery of each distribution of the sets of samples distributed by DEQAS you can monitor if the recovery is close to 100 % and if they kept good alignment with the reference method. That's what they saw with the variability of +/- 5 % on the average. We have addressed the standardization and I hope it was clear that it's important to choose an assay that has good accuracy and alignment with the reference method and can also maintain its alignment over time. Now we go to the second point which is the effect of the binding protein of the serum matrix on the accuracy of different assay. Back in 2012 Graham Carter which is the organiser of DEQAS reported that 25(OH)D is indeed difficult to analyse and explained that one of the critical steps is in fact releasing from the binding protein. I mentioned before that the molecule is so hydrophobic that it needs to be bound to binding protein to be able to circulate. The first step in any vitamin D assay is to be able to release the analyte that you want to measure from the binding protein. Ideally you want to either separate the binding protein or at least denature it, so that it doesn't go back to reassociate during the rise of the reaction. Up until 2012 there was actually no evidence that 100 % of the molecules were dissociated from the binding protein. The first study to prove this was from a group from Netherlands which looked at how the vitamin D protein concentration would affect the accuracy of the vitamin D assays. They compared a population of healthy subjects, that of which they considered normal vitamin D binding protein concentration. They compared it with a population with higher than normal vitamin D binding protein concentration, which is the population of pregnant women, and a population with lower than normal concentration of binding protein, which is an intensive care patient. What they did was taking a commercial available assay amd looked at its accuracy in popultaion of these patients in comparison with LC/MS population taken as a reference. In this slide we see the first four automatised assays: Liaison, Centaur, iSYS a Architect. In the next slide there's the Elecsys from ROCHE and RIA. What is in this table is in bold. It basically shows the significant deviation from LC/MS results, the deviation slope that is significantly different from 1 and the deviation in intercept significantly different from 0. Authors reported problems with this patient population with either lower than normal or higher than normal vitamin D binding protein with some assays as follows: for the intensive care patients or lower vitamin D binding protein the LC-MS/MS is considered sufficient in 20 % of these patients, while the LIAISON consideres sufficient 52 %. This means that some of the patients that actually we're not sufficient, based on the LC-MS/MS results, would not have been given the supplementation, even though they needed it. Also on the other side, in the pregnant women which have higher than normal vitamin D binding protein the opposite applies, so there was quite a good amount of woman which actually were sufficient according to LC-MS/MS. But only less than half of those were considered sufficient by Centaur and iSYS. In this case they were given supplementation when it was not needed. The only 2 assays that did not give these vitamin D binding protein concentration dependence were the Elecsys for the automated assays and the RIA. This RIA obviously can be explained, because the first step is the separation of the binding protein in the RIA. But all the automated assays have an automated pretreatment steps, so apparently the Elecsys pretreatment steps are more efficient than the other automatic assays in releasing the binding protein in a consistent and efficient way. Therefore there was no vitamin D binding protein concentration dependency and all the populations were closely aligned with the LC/MS method. The explanation for this behaviour of the majority of the automatised assays excluded Elecsys is that apparently in the presence of high vitamin D binding protein concentration not all of the binding protein is released and it therefore causes an interference and underestimation of vitamin D levels. A very similar study was done with haemodialysis patients. In this case only 3 methods were compared: Architect, Elecsys and iSYS. Each of them was compared to the LS/MC again as the reference. The very same analysis was done looking at the correlation with the reference. Elecsys and iSYS had very good correlation for both healthy subjects and dialysed patients with Elecsys being more closely aligned in terms of having slopes closer to 1. compared to the LS/MC method. On the other side there was a problem with the Architect, especially for dialysed patients with a misclassification of over almost 50 % of dialysed patients being identified as insufficient. Of course the reported results of this case may cause concern and lead to additional supplementation that is not needed. The way it is explained is that in this case the vitamins D binding protein levels are the same as the healthy controls, but the matrix is uremic, it has high concentration of urea which may interfere in this release of the analyte from the binding protein. The third factor that I want to focus on today are the metabolites, particularly the C3 epimer. We know that the C3 epimer is formed through a metabolization pathway that basically has an effect in position 3. It had formed the other isomer compared to the normal 25(OH)D3. It has been known for some time to occur in the neonates and in fact the C3 epimer concentration in the neonates can be up to 50 % of total vitamin D level. In 2012 there was the first report of C3 epimer presence in adults. This is how they reported the concentration, the distribution. You can see that the majority, 92 % of adults have C3 epimer concentration less than 3 ng/ml. So it's really low concentration. Let's say that C3 epimer cross reactivity is a concern, mainly for the neonates. The concern obviously arises from the claims that you can see on the manufacturers packages saying that we do report a cross reactivity spike with C3 epimer. Now I'm going to explain to you what difference it makes if you spike or if you have a native content of C3 epimer in the sample. All the manufacturers have to do a cross reactivity experiments by spiking C3 epimer at different concentrations in normal serum. We have seen that in adults serum had very low concentration. That's why we really don't have access to neonates. I don't know how many of you test the neonates in their routine, but it's very rare to get access to those samples. Therefore we have to do this experiment analytically by spiking the analyte in the matrix. However, this group from Netherlands led by Van den Ouweland was able to access a cohort of neonates, so with the increased or naturally high levels of C3 epimer. The C3 epimer presented up to 58 % of total D, which is really high concentration. They did comparison with the LC/MS and they have developed a LC/MS method which separates the C3 epimer from the 25(OH)D, so they were able to quantify both. What they expected considering the packaging claim was a discrepancy between their results of LC/MS and our assay, but in fact they were surprised to see that there was no C3 epimer recognition in this native samples by the Elecsys assay. On the other side they were able to reproduce the experiment that we call the spiking experiment. So when you spike a sample you obtain, you have a cross reactivity, you have an overestimation of the total content. But if you take native samples, then this doesn't occur. Now the conclusions. I just want to raise a couple of points. I hope it is clear how important is that a lab chooses a method they want to use based on criteria of throughput, but also based on the patient population that they expect to have in their routine. The assay standardisation is very important, but it has to be maintained over time with a good lot-to-lot consistency. It's important that if you have pregnant or dialysis patients in your routine, which are part of those populations for which the test is indicated. You consider a test that doesn't have any interference with the binding protein. I hope I have given you enough evidence from the literature that the Elecsys has all these features in terms of reliable standardization and lot-to-lot consistency and the accuracy in many patient populations, including the neonates with natively high C3 epimer content. Thank you for your attention.

Podcast

Přehrajte si zvukovou stopu videa:

Podívejte se i na další přednášky webcastu XII. sjezd České společnosti klinické biochemie - webcast.

Související články

Test Elecsys® Syphilis představuje rychlý a spolehlivý způsob detekce specifických anti-treponemových protilátek v časných i pozdních fázích infekce. Ve srovnání s tradičními precipitačními a aglutinačními metodami minimalizuje riziko falešně negativních výsledků a umožňuje jednoznačnou interpretaci výsledků ve všech fázích onemocnění.

Elecsys AMH je plně automatizovaná metoda pro kvantitativní in vitro stanovení Anti-Müllerian hormonu v lidském séru a plazmě. Přednáška popisuje roli vyšetření AMH v klinické praxi a seznamuje přítomné s výsledky rozsáhlých externích a interních multicentrických evaluací.  

Zahajovací přednáška bloku Žena a zdravé těhotenství, který byl zařazen do Sympózia laboratorní medicíny 2014, představila  spektrum metod vyšetřování těhotných žen nebo žen plánujících těhotenství. Přednášející seznamuje s metodou stanovení AMH (Anti-Müllerian hormonu) pro odhad ovariální rezervy, s metodami prenatálního screeningu, věnuje se především biochemickým markerům a jejich významu v jednotlivých trimestrech (AFP, uE3, hCG, free beta-hCG a PAPP-A, inhibin A).