Technical and clinical performance of Elecsys® Vitamin D total. Technické a klinické parametry Elecsys®, měření celkového vitaminu D.

Přednáška představuje nová technická a klinická data o Elecsys® Vitamin D total včetně uvedení do problematiky vitaminu D. Přednáška je opatřena českými titulky.

TIP: Pro lepší zážitek zvolte režim "Celá obrazovka" (ikonka vpravo dole na liště)

Video

Textový přepis

Tip: Kliknutím na místo v textu, přetočíte přehrávané video.

Dobrý den, je pro mě ctí být dnes zde a prezentovat nějaká data o technických a klinických parametrech našeho testu Elecsys a analýzy celkového vitaminu D. Začnu nějakými základními informacemi k vitaminu D; co bychom měli testovat, trochu více půjdu do detailů, a ukážeme si analytická data, technické parametry a klinická data z různorodé populace. Jen krátký úvod. Jsem si jistá, že většina z vás ví, že vitamin D není až tak vitamin, ale spíše hormon, který je produkován kůží po expozici slunečnímu osvitu. To je ta D3 forma. Ale ve skutečnosti se do těla může dostat i jako součást potravy či potravinových doplňků, a to ať už ve formě D3 nebo D2. Co se děje, když se vitamin D dostane do cirkulace? Na prvním místě je třeba říci, že je to hydrofobní molekula, takže se musí navázat na protein, aby byl schopen přetrvat v lipofilním prostředí. A toto platí pro všechny metabolity vitaminu D. Jak vidíme zde – vitamin D vstupuje do cirkulace, dostává se do jater, kde dochází k jeho hydroxylaci na pozici 25. Vzniká tak zásobní forma vitaminu D. To je ta forma, kterou měříme, když určuje status vitaminu D. 25 - hydroxycholekalciferol je dále hydroxylován převážně v ledvinách na 1, 25 - dihydroxycholekalciferol. A 1, 25 - dihydroxycholekalciferol je ta aktivní molekula. Je to hormon, který působí ve střevě, v příštítných tělískách, v kostech tak, aby zajistil homeostázu kalcia. Absorbuje kalcium ze střeva, z kostí, a zajišťuje konstantní hladinu kalcia v cirkulaci. Takže proč měříme formu 25 a ne 1, 25? Za prvé, jak už jsme řekla, forma 25 je zásobní a jak můžete vidět zde, její biologický poločas je 2-3 týdny. Proto říkám, že to je zásobní forma. Forma 1,25 je produkována, pouze pokud je potřeba. A má velmi krátký biologický poločas, 3-4 hodiny. Proto zásobní forma je ta, kterou bychom měli měřit, když chceme vědět, jakou zásobu vitaminu máme, abychom byli schopni si vytvořit tu 1, 25 aktivní formu. Na druhou stranu bych ráda poukázala na to, proč bychom neměli měřit formu 1, 25. Zde bych ocitovala některé odborníky. Prvním z nich je profesor Hollis, velmi známý odborník na vitamin D. On vysvětluje, že měření 1, 25 formy má velmi malou užitečnost. Je užitečné pouze u velmi vzácných chorob, jako je rachitis závislá na vitaminu D2, či hypofosfatemická rachitis, získaná nebo dědičná. To jsou velmi vzácná onemocnění. Tou nejčastější z nich, pro kterou stanovení formy 1, 25 má diagnostický význam je sarkoidóza, což je granulomatózní onemocnění. A i zde je incidence 14 na 100 000. Čili klinické využití opravdu malé. Na druhou stranu, existuje řada kliniků, kteří řekněme nechápou, nebo neberou v potaz, a náhodou, nebo neznalostí, si v testovacím panelu zaškrtnou formu 25 i 1, 25. Prostě zaškrtnou obě varianty. Tak by to ale být nemělo. Protože forma 1, 25 je velmi úzce regulována PTH. A nedává nám v podstatě žádné informace o statutu vitaminu D. Je to forma 25 – hydroxycholekalciferol, která by měla být měřena. Profesor Thadani, který je nejen odborníkem v oblasti vitaminu D, ale také nefrolog, dále poukázal na to, že existuje určitý chybný koncept toho, jak vnímají nefrologové 1, 25 formu. Nejlepší postupy, vycházející z doporučení Harvardské University ke zhodnocení kostního metabolismu u pacientů s chronickým onemocněním ledvin, měří PTH, kalcium a 25 – hydroxycholekalciferol. Takže i guideliny, které tvoří doporučení k managementu chronických onemocnění ledvin, jsou proti měření 1, 25 formy, protože stanovení hodnoty 1, 25 nám neposkytuje žádnou přídatnou informaci, žádné vodítko k léčbě pacientů. Takže pokud pacient užívá aktivní vitamin D v léčbě, měl by být monitorován prostřednictvím měření hladiny kalcia, ne měřením hladiny 1, 25 formy vitaminu. Čili, je jasné, že bychom měli stanovovat 25 – hydroxycholekalciferol. Ale u jaké populace a kdy? Nyní existuje konsensus daný několika klinickými společnostmi a experti se shodují, že existuje určitá část populace, která je v riziku deficitu vitaminu D, a která by benefitovala z testování hladiny 25 – hydroxycholekalciferolu. Jsou vyjmenováni zde. Pacienti s osteoporózou, nebo rizikem rozvoje osteoporózy, pacienti s osteomalacií, postarší pacienti, kteří jsou v riziku pádů a fraktur, hospitalizovaní a ležící pacienti, ale také pacienti s abnormálním metabolismem, kvůli těhotenství, kvůli obezitě, kvůli chronickému onemocnění ledvin. Všichni tito pacienti by měli být testováni v úvodu, čili před tím, než zahájíme suplementaci, a pak tři měsíce po zahájení suplementace. Po třech měsících by měl být zhodnocen status vitaminu D, abychom zkontrolovali, zda dosáhli požadované hladiny. Co je tou požadovanou hladinou? V tom ještě není úplně shoda a konsensus. Existují dva odlišné, řekněme, názory. Endokrinologická společnost, Společnosti pro léčbu osteoporózy, považují cut-off 30 ng/ml jako suficientní hladinu vitaminu D, jako optimální hladinu, zatímco Institut medicíny v USA má více konzervativní přístup, kdy považuje za dostatečnou hladinu 20 ng/ml, jakožto cut-off. Nicméně, není tak důležité, co si váš lékař vybere, důležité je testovat v úvodu a po třech měsících. Proč? Protože ne všichni z nás zareagují na suplementaci stejně. Já mohu být jedním z těchto jedinců, kteří užívají 100 mezinárodních jednotek za den, a mé hladiny, od té úvodní, vzrostou jen na 10 ng/ml. Ale vy můžete být ten, jehož hladiny vzrostou na 20 ng/ml. To je těžké predikovat, a existuje řada faktorů, které máme tady vyjmenované, které přispívají k této interindividuální variabilitě. Jediným způsobem jak to zjistit, je opravdu to změřit. Pojďme k detailům rozboru. Nejprve ze všeho je třeba uvést, že je to kompetitivní assay založená na vitamin D vázajícím proteinu, a je třeba zdůraznit, že první krok reakce je velmi důležitý. Jak jsme si řekli, vitamin D cirkuluje navázaný na vazebný protein. Takže prvním krokem, jak analyzovat vitamin D, je uvolnit ho z této vazby. To se provádí speciálními reagenciemi, kterým se říká úpravné reagencie. Nejde jenom o uvolnění vitaminu D, který chceme měřit, z vazby, ale také o denaturaci toho vazebného proteinu, takže se nemůže už znovu seskupit v dalších krocích. K tomuto bodu se ještě dostaneme, zapamatujte si ho. Tato úprava je velmi důležitým krokem. Druhým krokem je použití značeného rekombinantního vitamin D vázajícího proteinu, který naváže analyt, a použití biotinylovaného vitaminu D, který zabírá ta místa, která zůstala volná. Toto celé se váže na streptavidinové kapičky a tento celek je elektroiluminiscenční. Co je důležité na rozboru vitaminu D? Je to jeho přesnost. Přesnost můžeme zajistit, nebo garantovat, pouze při dobré standardizaci assaye. S Elecsys jsme byli ve skutečnosti první společnost, která assay standardizovala dle tekuté chromatografie tandem-mass spektrometrie (LC-MS/MS), která je uznávaná jako referenční metoda. Jak jsme to udělali? Pojali jsme mezinárodní standardy z NIST (National Institute of Standard and Technology), a použili jsme je ke kalibraci našeho vlastního LC-MS/MS, a pak jsme naopak testovali a znovu přepisovali hodnoty kalibrátoru užitého pro Elecsys na LC-MS/MS. Elecsys je standardizovaná a zajistili jsme i zpětnou sledovanost a zjistitelnost hodnot. Můžeme si být jisti, že naše LC-MS/MS je standardizována v souladu s mezinárodními standardy. Výsledkem toho je přesnost srovnatelná s referenčními metodami. Nevím, jestli DEQAS je běžný v České republice. Je to externí hodnocení kvality ve Spojeném Království specifické pro vitamin D. Od října 2012 cílové hodnoty DEQAS jsou převedeny dle NIST standardů. NIST LC-MS/MS je jednou ze dvou světově uznávaných referenčních metod. Jedna je v USA – NIST LC-MS/MS a druhá v Evropě, Ghent, belgická. Na tomto slidu vidíte, jak přesná Elecsys assay je. Výsledky jsou založeny na vzorcích obdržených z NIST. Na následujícím slidu uvidíme belgickou Ghent LC-MS/MS. Na tomto slidu můžeme ocenit, že průměrné hodnoty dosahované Elecsys jsou v rozmezí 5-6% cílových hodnot převedených z NIST. Čili opravdu velmi blízko cílovým hodnotám, v rozmezí 5%. Jak už jsem předeslala, na tomto slidu máme výsledky přesnosti hodnocení vůči hodnotám Ghentu. Tento panel výsledků byl představen v poslední době, kde tečky značí dárcovské vzorky, čili v symbolech ještě reprezentativnějších, jednotlivý pacient versus Ghent referenční hodnoty. Tady vidíte v grafu. Průměrná bias Elecsys versus Ghent LC-MS/MS je v rozmezí 5%. A 5% je kritérium přesnosti pro rutinní metodu. Tedy máme potvrzeno, že Elecsys je opravdu přesná metoda v porovnání s metodou referenční. Pojďme více do detailů analytické části. Budu prezentovat výsledky multicentrického hodnocení, které byly v poslední době publikovány. Hodnocení bylo prováděno v několika vědeckých centrech po celém světě. Tato publikace obsahuje 2 slidy z Austrálie a 2 slidy z Evropy – Německa a Nizozemí. A jak vidíte zde, Elecsys assay byla prováděna na různých analyzátorech (e411, e601, e170) a účelem hodnocení bylo ověřit robustnost této vyšetřovací metody v reálných podmínkách. Ve všech centrech byla prováděna měření přesnosti, srovnání položky vůči položce, funkční sensitivity a porovnání plazmy a séra v některých centrech. Všechna centra porovnávala se svými vlastními rutinními vzorky provedení Elecsys assay vůči provedení LC-MS/MS jakožto referenční. Ale také porovnávali Elecsys s jinou imunoassay – LIAISON, IDS-iSYS a také s HPLC metodou. Přesnost byla kalkulována na vzorcích s nízkou, střední a vysokou koncentrací, které byly poskytnuty každým z těch center. Jednalo se o jejich rutinní vzorky. A stejně tak kontroly měření. Měření byla porovnávána v rámci laboratoře, i mezi laboratořemi. Testování probíhalo několik dní, 10 dní v některých centrech, 21 dní v některých jiných. Ale z grafu je poměrně jasně patrné, že všechny koeficienty variací (CV) byly pod 10%, jak v rámci jedné assay, tak mezi jednotlivými assayemi. Což značí velmi dobrou přesnost, a to ve všech koncentracích, čili v celém klinickém spektru. A opět, je zde jedno kritérium, které bylo navrženo – že testy a assay by měly mít koeficienty variace menší než 10% na to, aby byly uznány vhodnými na rutinní stanovování hladiny vitaminů. Potom byla testována přesnost mezi jednotlivými laboratořemi. Vzorky sér byly distribuovány do jednotlivých míst. Tento experiment probíhal také v různých dnech. A rovněž bylo dosaženo koeficientů variace v rozsahu maximálně 10%. Čili přesnost velmi dobrá. Byla počítána také znovuobnova dat, porovnáním mediánu hodnot daného centra na určitém vzorku, s mediánem hodnot stejného vzorku měřeného v jiném centru. Můžeme opět ocenit, že to znovunabytí dat je opět 100% +/- 10%, což značí dobrou konzistentnost výsledků napříč různými laboratořemi, v různých dnech a na různých přístrojích. Je to opravdu dobrý výsledek. Rozbory jsou prováděny s vysokou sensitivitou. Koncept funkční sensitivity je vám jistě blízký, provádí se na vzorcích s nízkými koncentracemi. V tomto případě všechny vzorky, navzdory nízkým koncentracím, měli koeficienty variace menší než 20%. Čili funkční sensitivita je definována na vzorku s nejnižší koncentrací 9,8 nmol/l. Což je hladina opravdu nízká. Koeficient variace byl opravdu dobrý – méně než 13%. Pod 20% splňuje definici dobré funkční sensitivity. Z toho vyplývá, že assay má velmi dobrou přesnost i na nízkých hladinách a je tedy schopna identifikovat i těžce deficientní případy, které vyžadují vyšší dávky suplementace. Také důležitá je konzistentnost výsledků jednotlivých měření v závislosti na reagencii. Během multicentrického vyhodnocování z jednotlivých studijních center prováděli porovnání mezi měřením řekněme A a B, C a D, a průměrná bias byla 3% a 4%. Čili velmi dobrá komparabilita měření. Jedno centrum pokračuje v monitorování assay v průběhu času, celých 13 měsíců, pokračuje dále se svými interními vzorky a na tomto grafu můžete vidět s odlišnými symboly měření s odlišnými reagenciemi. Celých 13 měsíců oni obměňují ty 4 položky měření, a získali velmi úzké koeficienty variace (CV), což je dokladem konzistentnosti rozboru po celý čas, v jednotlivých položkách, s různými reagenciemi. Může proto být použito pro monitorování pacientů. Zde vidíte srovnání s LC-MS/MS, která je brána jako referenční. Proč je tomu tak? Tato LC-MS/MS metoda byla NIST standardizována. Takže dvě referenční metody, testovali vzorky ze tří studijních center a jeden z Nizozemí. Je zde patrná určitá variabilita mezi jednotlivými centry. To je normální. Je to dáno odlišnou metodou a také odlišnou pacientskou populací. Vychází to také z jejich rutinního postupu. Nicméně, všechny se pohybují v rozmezí 15% od LC-MS/MS. Závěrem lze říci, že vše je ve shodě s LC-MS/MS metodou. Na druhou stranu porovnání s imunoassay, HPLC. Když se podíváme na porovnání každé z těchto metod s LC-MS/MS, vidíte, že DiaSorin podhodnocuje v porovnání s LC-MS/MS – minus 25%; IDS-iSYS přidává, 45%, což je věc, která byla patrna také na výsledcích jiných studií, pokud jste na nich participovali, a HPLC bylo svými výsledky blízko LC-MS/MS. A porovnání Elecsys versus ostatní metody – dá se v zásadě říci, že koresponduje s bias těch ostatních metod vůči LC-MS/MS. Elecsys je více, než ta porovnávaná metoda, protože ta je vždycky méně než LC-MS/MS. Toto tedy můžeme očekávat, pokud přejdeme od jedné metody k druhé. Mějte na paměti, že my jsme porovnávali přesnost měření Elecsys vůči ostatním metodám - LC-MS/MS, NIST, Ghent referenčními metodami. A v neposlední řadě – měření v různé pacientské populaci. Hovořili jsme o vitamin D – vázajícím proteinu a o uvolnění z této vazby, jakožto o velmi významném kroku. To je skutečně ta výzva ve vývoji rozboru vitaminu D – jak popisují autoři v této publikaci. A způsob, jak se s touto výzvou vyrovnat a zaznamenat odlišné projevy v závislosti na hladině vitaminu D, je měřit různorodou pacientskou populaci, která má různou koncentraci vitamin D vázajícího proteinu a podívat se na korelaci s LC-MS/MS. A jaká tedy populace? Těhotné ženy, které představují tu část populace, u níž by vitamin D měl být testován. Představují část té rizikové populace, kterou jsme viděli na začátku prezentace, má vyšší hladinu vitamin D vázajícího proteinu než je normální. Na druhé straně pacienti na JIP mívají nižší hladinu vitamin D vázajícího proteinu, než je normální. Ve studii dále byly zahrnuty i jiné skupiny pacientů, např. dialyzovaní pacienti atd. Ale zaměřme se nejprve na těhotné ženy a JIP pacienty. Máme na tomto slidu mnoho čísel, já se nechci příliš zaměřovat na čísla, chci se zaměřit více na ten obsah na tomto slidu. V základu lze říci, že tyto studie zahrnuly šest metod – rutinních metod používaných pro testování vitaminu D. Tři vidíte na tomto slidu a tři uvidíte na následujícím slidu. To, co je zeleně a tučně, to se nejvíce odchyluje od LC-MS/MS, což je referenční metoda. Můžeme ocenit, že nějaké odchylky tu máme. A autoři, aby to zjednodušili, u údajů uvedli, co tam bylo za problém. Například, že pacient mohl být špatně zařazen, či klasifikován. Ve skutečnosti, v populaci JIP pacientů, kteří mají nejnižší hladinu vitamin D vázajícího proteinu, pozorovali, že 20% těchto pacientů bylo testováno jako vitamin suficientní skupina v LC-MS/MS. Čili pouze 20% těchto pacientů má hladinu nad 30. Nicméně pokud byla použita jiná metoda – LIAISON – více pacientů bylo klasifikováno jako vitamin D suficientní – 52%. To je více než dvojnásobek než LC-MS/MS. Co to znamená? Pokud více pacientů vyhodnotíme jako suficientní, je jasné, že nedostanou suplementaci vitaminu D. Pacienti, kteří by léčbu potřebovali, ji nedostanou. Takže má to i klinický dopad. Na druhé straně máme populaci těhotných žen, u kterých je hladina vitamin D vázajícího proteinu vyšší než norma a 67% z nich bylo LC-MS/MS vyhodnoceno jako suficientní, ale další dvě metody - Centaur a iSYS – vyhodnotily jako suficientní pouze 24% a 25% pacientek z této populace. Takže zase z druhé strany – tato populace, pokud bude testována touto metodou, dostane více vitamin D suplementace, než je opravdu třeba. Je zde tedy reálná obava, že těhotné ženy budou suplementovány více, než je potřeba. Tady vidíme ty další 3 metody. Architect, Elecsys a RIA. A pouze Roche automatizovaná assay Elecsys a RIA, která separuje vazebný protein v solitárním manuálním kroku, nebyly ve svých výsledcích ovlivněny hladinou vitamin D vázajícího proteinu a jejich výsledky byly ve shodě s LC-MS/MS v jakékoliv pacientské populaci. Vysvětlením je, že některé metody, ty, u kterých došlo ke špatné klasifikaci pacientů, neumí úplně uvolnit vitamin D z vazby na jeho vazebný protein. A to dává odlišné výsledky vůči LC-MS/MS, zatímco Roche assay tímto není ovlivněna, díky úvodnímu kroku. Stejná studie byla provedena – nebo spíše následovala tu předchozí, která zahrnula i dialyzované pacienty, aby se blíže podívala na tuto část populace. Je to skupina pacientů, kde je doporučeno testovat 25 – hydroxy formu; jedná se o rizikovou skupinu a je u ní důležité mít přesnou metodu měření. Byl aplikován stejný koncept. Korelace s LC-MS/MS. Zelené, tučné jsou odchýlené hodnoty. U této populace byl problém s testem Architect, který vyhodnotil 45% dialyzovaných pacientů jako vitamin D insuficientní, důsledkem čehož u nich byla navýšena suplementace více, než by bylo nutné. Zatímco Elecsys prokázala nejlepší korelaci s LC-MS/MS. Tolik k vysvětlení. Svou roli také u dialyzovaných pacientů hraje vyšší hladina urey, která nějakým způsobem vstupuje do procesu uvolňování z vazebného proteinu, tolik alespoň hypoteticky – ale Elecsys tento vztah neovlivňuje. Již jsme na konci naší dlouhé cesty; ukázali jsme si spoustu dat, ale doufám, že to, co zůstane ve vašich hlavách po skončení této prezentace, je, že máme z několika publikovaných studií potvrzeno, že naše assay je robustní metoda, což prokázala v analytické i klinické části; viděli jsme dobrou komparabilitu s referenční metodou, NIST, Ghent a LC-MS/MS metodou a také, že přesnost se zachovává v každé populaci pacientů, že není závislá na hladině vitamin D vázajícího proteinu, porovnání jednotlivých vzorků si zachovává konzistentní výsledky a dobrou přesnost, což umožňuje monitoring pacientů. Také má velmi dobrou funkční sensitivitu, která umožňuje identifikaci závažně deficientních případů. S tímto slidem bych vám ráda poděkovala za pozornost a jsem připravena zodpovědět vaše otázky.

It's an honor to be here and to present some data about technical and clinical parameters of our Elecsys test and vitamin D assessment. I will start with some background on vitamin D, which marker should be tested and to go for more details of the product, the data about the analytical and technical performance and performance in different clinical population. Just as a introduction, I'm sure that most of you know that vitamin D is not really a vitamin, but is rather a hormon, which is produced in the skin due to exposure of the sunlight. This is the D3 form, but actually it can get into the body in some food or supplements, either in D2 or D3 form. So what happens when vitamin D gets into circulation? First of all it's a very hydrophobic molecule, so it has to be bind to a protein to be able to stay in a lipophylic environment. This is the case of all of vitamin D metabolisms. As we see here, vitamin D enters the circulation, it goes to the liver where it is hydroxylated in position 25. That's the storage for vitamin D. That's what is measured to assess vitamin D status. Then the 25(OH)D is further hydroxilated mainly in the kidneys to 1,25(OH)2D. 1,25(OH)2D is the active molecule. It's a hormone which acts in the intestine in parathyroid glands and on the bone, to be able to ensure calcium homeostasis. So it absorbs the calcium from the intestine, bones and maintains constant level of calcium circulation. So why do we measure 25 and not 1,25? First of all I said that the 25 is a storage form and as we see here, the half life is 2 to 3 weeks, so that's why I say it's a storage form. 1,25 is produced only when needed. It has a very short hald life of 3 to 4 hours. The storage form is the form that should be measured to understand how much supply do we have to be able to produce the 1,25 active form. On the other hand I just want to explain why 25 should not be measured. We have here some a quote from opinion leaders. First is from professor Hollis who is well known vitamin D expert. He explains that 1,25 measurement has very little utility. It's only useful in very rare diseases, like vitamin D2 dependent rickets or hypophosphatemic rickets, aquired or inherited. These are very rare diseases. The most common one for which 1,25 form has diagnostic significance is sarcoidosis, which is granulomatosis disease. The incidence here is 14 per 100 000. So this means that it's rarely of a clinical utility. On the other hand though, there are some patients who do not really understand, consider or know this and probably check 25 and 1,25, the both options. It shouldn't be the case, because 1,25 is very well regulated by PTH, so it doesn't really give any information about vitamin D status. It's the 25 hydroxycholecalciferol that should be measured. Okay? Another point was made by professor Thadani who is well known vitamin D expert but also nephrologist from Harvard. He explained that unfortunately there is a misconception about requirement for nephrologistsc as for 1,25. In fact what they do at Harvard was to assess the bone metabolism of chronic kidney disease patients by measuring PTH, calcium and 25(OH)D. In fact, even the guidelines which regulate and advise on the management on chronic kidney disease patients actually have recommendation against the measurement of the form 1,25, because this value doesn't add any information or any guidance for the treatment of the patients. So it the patient takes an active vitamin D as a treatment, it should be monitored by looking at the calcium levels, but not the 1,25 levels. It's clear I think that we need to measure 25(OH)D. But in which populations and when? There is quite a consensus nowadays from different clinical societies and experts who agreed that there are a number of populations at risk in vitamin D deficiency that would benefit from the testing of the 25(OH)D. They are listed here. We can see patients with or at risk for osteoporosis or osteomalacia, then the elderly, which are at risk for falls and fractures, institucionalised patients, but also patients that have an abnormal metabolism due to pregnancy, obesity or a chronic kidney disease. All of them should be tested at the baseline, which means before the supplementation is provided, and then after 3 months the supplementation started. After 3 months, patient should be assessed for the vitamin D status to see if they achieved desirable levels. Now, what are desirable levels? There is not a consensus yet, but there are two different opinions. The Endocrine Society and the International Osteoporosis Foundation consider cut-off 30 ng/ml for vitamin D sufficiency for optimal levels, while in the Institute of Medicine in th U.S. they have a more conservative approach: they consider 20 ng/ml as the cut-off level. But nonetheless it doesn't matter what your clinicians think. What is important is that the baseline ends after 3 months. Why? Because actually not all of us will react in the same way to the supplementation. I may be one of these individuals who took 100 international units per day of vitamin D supplement and my levels from the baseline will only increase by 10 ng/ml in 6 months. But you may be another individual, whose levels will increase by 20 ng/ml. So it's pretty hard to predict and there is a number of factors listed here which contribute to this inter-individual variability. The only way really is to test. Now let's go to the details of the assay. First of all the format is a competetive assay based on the vitamin D binding protein. Here I want to stress the fact that the first set of the reaction is very important. We said that vitamin D circulates binded to the binding protein. So, the first step to measure the analyte is to release it from the binding protein. This is done by some specific reagents called pretreatment reagents, which not only release the vitamin D that we want to measure from the binding protein, but also denature the binding protein. It cannot be associating the followinf steps. When we come back to this, remember that pretreatment is a very important step. The second step is the use of labelled recombinant vitamin D binding protein to bind the analyte and the use of a biotinylated vitamin D thar occupies the other sides that remained free in the recombinated protein. This binds to the streptavidin beads and so these complexes are the ones that release the electroluminescence. What is important in the vitamin D assay? It's the accuracy. We can maintain or guarantee accuracy only if there is a good standardization of the assay. With Elecsys we were actually the first company that standardized the assay to the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS), which is recognized as a reference method. So, how did we do that? We took the international standards from the NIST (National Institute of Standard and Technology) We used them to calibrate the our LC-MS/MS and then we tested them, we resigned the values of the calibrator's use for the Elecsys or LC-MS/MS method. We maintained this traceability chain through which the Elecsys is standardized to trace the standards through the LC-MS/MS method. It's good to have an LC-MS/MS in house because we can really maintain this anchor for LC-MS/MS, we can check every lot and be sure that our standardization is still the same and is still aligned with the international standards. The effect of this is that the accuracy is comparable to the reference method. I don't know if DEQAS is common in Czech Republic. It's a an external quality assessment scheme for professional testing in the U.K. that is specific to the vitamin D. Since the October 2012 the target values of DEQAS samples are actually signed by the NIST LC-MS/MS, which is one of the two worldwide recognized reference methods. One is in the U.S. (the NIST LC-MS/MS) and one is in Europe (the Ghent LC-MS/MS, Belgium). In this slide you see how accurate the Elecsys assay is. Based on the values of the DEQAS samples, but guided by the NIST LC-MS/MS. In the next slide we will see the Ghent LC-MS/MS. So here you can appreciate that the mean values of Elecsys is within 5 - 6 % from the target values asigned to the NIST. That's really close to the target values, within 5 %. As I said, this slide presents results of the accuracy of the Ghent to the other reference methods. This is possible because this results panel was released recently, made of donor samples (dotted), so even more representative of single patients asigned to the Ghent reference method. Also in this case you can see the mean bias of the Elecsys vs. Ghent LC-MS/MS within 5 %, which is the criterium for accuracy for the routine method. In Elecsys assays is confirmed that it's accurate method compared to both reference methods. Let's go more into details of the analytical performance. I'm going to present results of the multi-centric evalutation that has recently been published. The evalutaion was performed in several scientific centers in the world. Thisi publication includes two slides from Australia and two slides from Europe: Germany and The Netherlands. You see here that the Elecsys assay was perfromed in different analysers (e411, e601, e170) and purpose of the evaluation was really to prove the robustness of the assay in real life conditions. The experiment was performed with precision in all centres as lot-to-lot comparison, functional sensitivity and serum-plasma comparison in some cases. All of the centres compared with their own routine samples the performance of the Elecsys assay compared to the LC-MS/MS as the reference method. They also compared the Elecsys with other immunoassays: LIAISON, IDS-iSYS and also the HPLC method. The precision was calculated on samples with low, middle and high concentrations, which were actually obtained or produced by each center, using samples from their routine. It also included controls of the assay. The controls were compared in the same run, which increased the precision, and also within labs. The testing was performed over several days: 10 days in some centres, 21 days in others. But you can easily see from the graph that all of the coefficients ov variation (CV) were bellow 10 %, both within and between assays, which is very good precision, and in all of the concentration, so in the whole relevant clinical range. And again, there is a criterium that has been proposed for routine testing. It says that the CVs should be less than 10 % to be fit for the performing routine vitamin level. Then, that precision was tested between-lab using serum pools that were distributed to the different centres. This experiment was also performed in different days. In this case it also had the CVs with maximum of 10 %. That's very good precision. The recovery was calculated comparing the median of the value of a center to the median of the same sample from another center. You can appreciate that most of the recoveries were again 100 % +/- 10 %, which means that there is good consisntecy of the results across the many labs, across different days and across different instruments. So this is really good result. The assasy performs with high sensitivity. You are familiar with the functional sensitivity concept, the testing of samples with low concentration. In this case all of the samples despite the very low concentrations had CVs with less than 20 %, so the functional sensitivity is stated on samples with the lowest concentration: 9,8 nmol/l, wich is really low. The CV was really good: less than 13 %, which meets the definition of good functional sensitivity (under 20 %). This means that the assay has a very good precision also at the low levels and allows identification of severe deficient cases, which are the ones that require higher dosage of supplementation. Also very important is the lot-to-lot consisntecy. During the multi-centric evalutaion of the centres they performed a comparison of lot A, B, C and D. There was a mean bias of - 3 % and - 4 %, so very good comparability from lot to lot. But also one center continued to monitor the assay over time (13 months) using their own internal samples of patients. In this graph you can see with different symbols the different lots of reagents. Over 13 moths they changed 4 lots and they obtained very tight CVs, which gained them confidence that the assay is consistent over time across different lots and reagents. It can be used to monitor patients. Here is comparison with the LC-MS/MS which is stated as the reference method. Why? Because this LC-MS/MS method was NIST standardized, so there are two methods, that were taken as the reference ones, tested samples from 3 centres and one tested the sample from the Netherlands. You can see certain variability between centres. It's normal, it's due to different methods and also different patient population. We proceed from their routine. However, they're all within 15 % from the LC-MS/MS. Authors conlude that there is agreement with the LC-MS/MS. On the other hand we talked about the comparison with the immunoassay and HPLC. If you look at how each of those assays are compared to LC-MS/MS, you see here that the DiasSorin is underesimated compared to LC-MS/MS: - 25 %. IDS-iSYS is overestimated: + 45 %, which is something that has been seen in other studies, if you participated in that scheme. HPLC was quite close to the LC-MS/MS. This comparison of Elecsys vs. the other methods is basically corresponding with bias of the other methods towards LC-MS/MS. Elecsys results higher than the compared method because the compared method is always lower than LC-MS/MS. This is what to expect if we switch from one method to the other. Keep in mind that we have been proving the accuracy of the Elecsys method with the LC-MS/MS and also with NIST, Ghent and other reference methods. Last but not least the performance in different patient population. We talked about vitamin D binding protein and the release of the binding protein as a very important step. This is actually one of the challenges when developing vitamin D assay, as these authors describe in this publication. The way to challenge the assay and see there is a vitamin D dependant behaviour is to take different patient population which have different vitamin D binding protein concentration and look at their correlation with LC-MS/MS. So, which population? Pregnant woman population, which is one of the populations in which vitamin D should be tested. It's part of the high risk group we saw at the beginning of the presentation. It has higher than normal vitamin D binding protein. On the other hand the intensive care patients have lower than normal vitamin D binding protein. Then in the study were also another group of patients, the dialysis patients for example and so on. But first let's focus on pregnant women and intensive care patients. There's a lot of numbers in this slide and I don't want you to focus too much on the numbers, but I want to focus on how much relevant is the content of the slides. Basically, these published studies included six methods, routine methods used for vitamin D testing. In this slide you see three and another three will be in the next. What is green and bold is what deviates most from LC-MS/MS, which is the reference method. Despite some deviations you can appreciate it and the authors made it easier: in each case they stated what the problem was. The deviation means that there may be misclassified patient. So, in fact in the population of intensive care patient which have lower vitamin D binding protein level, they observed, that 20 % of these population was tested as vitamin D sufficient by LC-MS/MS. So only this amout of patients had levels over 30. However, in another method that was used, the LIAISON, more patients were classified as vitamin D sufficient: 52 %. That's almost more than double that the patients with LC-MS/MS. What does this mean? If more patients are considered sufficient, obviously they wouldn't be given vitamin D supplementation. So, that would be treatment of patients who acutally need the supplementation, but wouldn't receive it. This is a concern for clinicians. On the other hand we have a population of pregnant women for which the binding protein is higher than normal: in this case 67 % of those were estimated as sufficient, but another two methods, Centaur and iSYS, were estimated as sufficient only for 24 % and 25 % of this population. So this is the other way around. This population, if tested with this method, would be given more vitamin D supplementation than actually needed. Here we would be worried that the pregnant woman would be supplemented more than necessary. These are the other three methods: Architect, Elecsys and RIA. Only the fully automated ROCHE assay and the RIA, that separates binding protein, did not show vitamin D binding protein cincentration-depedent differences compared to the LC-MS/MS results. They were not affected with the concentration of the vitamin D binding protein in any patient population. Their explanation was that some methods, the ones that made wrong patient classification, are probably not capable of releasing vitamin D from the binding protein. Due to this there are different results towards the LC-MS/MS, while ROCHE assay is not affected by this due to the preparatory step. Similar study was done, actually this study followed the previous one which also included the dialysed patients to take a closer look at this population. In these patients is recommended to test it for 25(OH)D form because it's a high risk group, so it's important to have an accurate test here as well. So, the same concept was implied: correlation to LC-MS/MS. The green bold are all the deviations of the results. In this case there was also problem with the Architect test, which falsely reasigned 48.5 % of dialysed patients as vitamin D insufficient or defficient, which means that there was increase in supplementation more than necessary, while the Elecsys showed the best fit in the correlation with LC-MS/MS. So, this was explained. Due to uremic matrix of the samples, the dialysed patients have higher levels of it. This probably interferes with the mechanism of the release in the binding protein for the Abbott assay and it doesn't have an effect on the Elecsys. So, we're now at the and of a long journey. We saw a lot of data. I hope that what remains in your mind after the presentation is that we have a combination of multiple published studies that our assay is a robust method both in terms of analytical and clinical performance. We have seen a good comparability with the reference method, NIST, Ghent and LC-MS/MS methods; but also we have seen that this accuracy is true for all of the patients' populations that're not depending on vitamin D binding protein concentration. Seeing that the assay maintains good performance and precision from lot-to-lot, which allows them monitoring of the patients; and also that it has very good functional sensitivity which allows the identification of the severely defficient patients. With this I thank you for your attention and I'm here to answer your questions.

Podcast

Přehrajte si zvukovou stopu videa:

Podívejte se i na další přednášky webcastu Sympózium laboratorní medicíny 2014 - webcast.

Související články

Přednáška představuje portfolio Diagnostické divize Roche pro diagnostiku infekčních onemocnění. 

Lékař je hostem v životě pacienta

… tato věta zazněla na Euromedlabu při sympoziu Engaging patients with laboratory medicine. A nejen ta. Hodně se diskutovalo, zda a za jakých podmínek mají být pacienti seznamováni s výsledky svých laboratorních testů. Ale ještě mnohem větší prostor byl věnován odpovědím na otázku, PROČ by měli být s nimi obeznámeni a co jim to přinese. Následující článek je souhrnem informací, které jsem v průběhu sympozia stačila zachytit. Ne o všem se u nás takhle otevřeně hovoří.

Přednáška seznamuje s problematikou bolesti na hrudi v akutním provozu, s její etiologií a s možnostmi diagnostiky akutních koronárních syndromů. Přednášející se zabývá také doporučeními pro diagnostiku akutních koronárních syndromů a podrobně představuje rule-in a rule-out protokoly, které bylo možné implementovat díky stanovení hs TnT.