Novinky v testování HER2 u karcinomu prsu

Protein HER-2/neu (dále jen HER2), popsaný poprvé v roce 1982, je produktem přepisu onkogenu c-erbB-2 lokalizovaného na dlouhém raménku 17. chromozomu (17q21). Tento protein o molekulové hmotnosti 185 kD je zástupcem skupiny receptorů pro epidermální růstový faktor (EGFR). Kromě HER2 patří do této skupiny také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4.

Zdroj: RYŠKA, ALEŠ. Novinky v testování HER2 u karcinomu prsu. Breast Cancer News : časopis pro odborníky ve zdravotnictví. Srpen 2011, 1, 2, s. 13-17. Obsah čísla

Úvod

Karcinom prsu jako nejčastější zhoubné onemocnění žen v rozvinutých zemích, ČR nevyjímaje, budí jistě zaslouženou pozornost nejen v oblasti novinek terapeutických, ale rovněž v otázkách správné, přesné a rychlé diagnostiky. Alfou a omegou histopatologického vyšetření je nepochybně stanovení správné diagnózy, stupně diferenciace a pokročilosti onemocnění, postižení sentinelové uzliny,(1) vztahu nádoru k resekčním okrajům, apod. Pro svůj zásadní význam při volbě optimální léčby jsou dnes však u celé řady nádorů(2) vyšetřovány také speciální molekulární znaky, které pomáhají onkologovi lépe se rozhodnout při volbě optimálního terapeutického postupu, zejména tehdy, když se jedná o možnost podání ekonomicky náročné, tzv. cílené terapie. Proto byly také u karcinomu prsu do diagnostického standardu zahrnuty výsledky imunohistochemického vyšetření exprese hormonálních receptorů, proliferačních markerů (v dnešní době prakticky výhradně antigenu Ki67) a zejména onkoproteinu HER-2/neu (dále jen HER2). Přes zavedený systém vyšetřování HER2 existuje celá řada otevřených otázek a výzev pro budoucnost. Pozornost se soustředí zvláště na oblast kvality provedení a reprodukovatelnosti vyšetření, na volbu optimálního diagnostického postupu a také na ideální kritéria, s jejichž pomocí dokáže patolog s nejvyšší možnou pravděpodobností vyselektovat pacientky ke správné volbě optimální léčby.

V roce 2007 došlo ke změně kritérií pozitivity, což paradoxně vyvolalo určitá nedorozumění. Málo poznatků je zatím k dispozici u nádorů s diskordantním fenotypem (nesoulad mezi výsledkem imunohistochemie a in situ hybridizace).

Protein HER-2/neu a jeho význam u karcinomu prsu

Protein HER-2/neu (dále jen HER2), popsaný poprvé v roce 1982, je produktem přepisu onkogenu c-erbB-2 lokalizovaného na dlouhém raménku 17. chromozomu (17q21). Tento protein o molekulové hmotnosti 185 kD je zástupcem skupiny receptorů pro epidermální růstový faktor (EGFR). Kromě HER2 patří do této skupiny také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4. Tyto 4 molekuly jsou do značné míry homologní – mají extracelulární doménu, na kterou se váže ligand daný receptor aktivující, transmembránovou doménu a intracelulární doménu, která se vyznačuje tyrozinkinázovou aktivitou, díky které je signál předán k dalšímu zpracování.(3)

Na samém počátku signální dráhy je moment dimerizace receptoru – homodimerizace, či v případě vazby na jiný receptor z rodiny HER – heterodimerizace. Jednotlivé molekuly skupiny HER se od sebe poněkud liší – právě HER2 je jediným zástupcem, který není přímo aktivován svým ligandem (má “necitlivou”, či “slepou” svou extracelulární doménu), a podílí se tak na procesu dimerizace spontánně a z celé skupiny HER receptorů nejochotněji. Následná fosforylace a aktivace signální dráhy vede ke zvýšené proliferaci, zablokování apoptózy, zvýšené vaskularizaci nádoru a vyššímu metastatickému potenciálu. Proto je HER2 u karcinomu prsu považován za jednoznačně nepříznivý prognostický faktor.(4)

U některých nádorů (karcinomy prsu, slinných žláz, pankreatu, endomeria, ovaria) je tento receptor zvýšeně exprimován – místo desítek tisíc molekul, které jsou přítomny na povrchu normálních epiteliálních buněk, je jich u tumorů s overexpresí HER2 na membráně nádorové buňky přítomno několik stovek tisíc až milion kopií. Příčinou overexprese, vyskytující se u zhruba 15 procent všech karcinomů prsu, je v naprosté většině případů amplifikace genu c-erbB-2.(5) Pozitivita HER2 (ať již stanovená imunohistochemicky [IHC] na úrovni proteinu, nebo in situ hybridizací [ISH] na úrovni genu), bývá významně častější zejména u nádorů nízce diferencovaných, častěji u karcinomů duktálních než lobulárních.(6)

Jak bylo již výše řečeno, až do 90. let minulého století byla zvýšená exprese HER2 považována pouze za negativní prognostický faktor.(4) Avšak se zavedením trastuzumabu (HerceptinTM) do léčby se HER2 stal z markeru čistě prognostického rovněž markerem prediktivním. Jeho vyšetřování se ukázalo být zcela zásadním pro selekci těch pacientek, které jsou pro léčbu trastuzumabem vhodné.

Novinky v kvantitativních kritériích HER2 pozitivity

Stojíme před – jen zdánlivě jednoduchou – otázkou, jak definovat HER2 pozitivní karcinom prsu. V dřívější době byly jako nádory HER2 pozitivní označovány ty, které vykazovaly silnou imunohistochemickou membránovou pozitivitu (3+) ve více než 10 % nádorových buněk, nebo nádory s amplifikací genu c-erbB-2 definovanou jako průměrný absolutní počet kopií genu v jádře >4, nebo jako poměr mezi počtem kopií genu c-erbB-2 a počtem signálů centromerické oblasti 17. chromozomu >2.

V roce 2007 American Society of Clinical Oncology (ASCO) a College of American Pathologists (CAP) vydaly společné doporučení, které změnilo kritéria HER2 pozitivity.(7) Pro imunohistochemii byl z důvodu eliminace nádorů s minoritní HER2 pozitivní komponentou zvýšen minimální podíl pozitivních buněk z původních 10 % na 30 %, u FISH pak byla zavedena kategorie hraničních nádorů, kde se poměr HER2/CEP17 pohyboval v rozmezí 1,8-2,2, případně v rozmezí absolutního počtu 4-6 kopií genu na jádro. V oblasti imunohistochemie se nejednalo o zásadní změnu. Heterogenních lézí s podílem pozitivní komponenty mezi 10 % a 30 % je relativně málo a i u těch, které budou z důvodu zvýšené hranice pro pozitivitu hodnoceny nikoli jako 3+, ale jako 2+, bude následně provedeno vyšetření in situ hybridizací, které potvrdí, zda je gen amplifikován, či nikoli.

Naproti tomu zavedení kategorie hraniční amplifikace vedlo k celé řadě nedorozumění. Důvodem pro zavedení hraniční kategorie byl fakt, že v důsledku interindividuální variability mohli dva různí hodnotitelé dojít při kvantifikaci počtu kopií genu k rozdílům, které nebyly matematicky velké (např. 1,9 versus 2,1), ale měly zásadní dopad na klinické rozhodování (nepodání versus podání Herceptinu). Proto bylo doporučeno, aby u nádorů, které budou spadat do hraniční kategorie, bylo počítáno větší množství jader, použit jiný tkáňový blok apod., tak aby se pokud možno prokázalo nade vši pochybnost, zda je nádor amplifikován, či nikoli. Pokud bude výsledná hodnota i nadále v hraniční oblasti, platí, že pro anti-HER2 léčbu jsou vhodné případy s hodnotou HER2/CEP17 2 a vyšší. Zatímco tedy pro stanovení ISH pozitivity (amplifikace) platí hranice poměru HER2/CEP17 2,2, pro indikaci terapie trastuzumabem nadále zůstává platná původní hranice 2,0.

Případy karcinomu prsu s diskordantním fenotypem

Obě běžně používané metody – IHC a ISH – se zaměřují na odlišné struktury. Ve většině případů je výsledek obou vyšetření konkordantní (obě vyšetření pozitivní, nebo obě negativní), míra shody mezi oběma metodami přesahuje 95 %,(8-10) u menšiny nádorů se však lze setkat s výsledky diskordantními (jedno z vyšetření pozitivní, druhé negativní). Tyto diskordantní výsledky neznamenají nutně selhání – falešnou pozitivitu či falešnou negativitu – jedné z metod, příčiny mohou být (a často jsou) důsledkem inherentních biologických vlastností daného nádoru. U nádorů IHC+/ISH jde nejčastěji o případy, kdy zvýšená exprese proteinu je způsobena polyzomií chromozomu 17 v nádorové buňce,(8) u nádorů IHC-/ISH+ může jít o důsledek změn struktury proteinu, který je následně imunohistochemicky nedetekovatelný.(11) Receptor při tom však může být nadále plně funkční a může být blokován anti-HER2 léčbou.

Celá řada studií prokázala, že amplifikace genu je prediktorem efektivity léčby trastuzumabem, bez ohledu na výsledek IHC; další studie(12, 13) však ukazují, že také pacientky a nádory IHC 3+ profitují z léčby trastuzumabem i v případě, kdy nebyla ISH prokázána amplifikace genu. Není tak překvapením, že dle analýzy dat ze studie HERA efekt léčby trastuzumabem nezávisí na stupni amplifikace genu, ať již hodnoceném pomocí indexu HER2/CEP17 nebo pomocí absolutního počtu kopií genu HER2.(12, 14) Zajímavým zjištěním je, že důležitější než poměr HER2/CEP17 je pravděpodobně absolutní počet kopií genu HER2 v jádře.(15, 16) Navíc, stav detekovaný jako polyzomie pomocí FISH nemusí být skutečnou polyzomií, ale ve značném počtu případů může jít pouze o současnou amplifikaci HER2 a centromerické oblasti chromozomu 17.(17)

Projekt HERretest a jeho výsledky V rámci ČR, stejně jako ve většině jiných rozvinutých zemí, probíhá testování HER2 u nemocných s karcinomem prsu primárně pomocí imunohistochemie; a u nádorů, které vykazují spornou (slabou) pozitivitu – skóre 2+ – je výsledek ověřován imunohistochemicky pomocí certifikovaných kitů a dále metodou in situ hybridizace v referenčních laboratořích. Pro anti-HER2 terapii jsou vhodné pacientky s nádory pozitivními imunohistochemicky (IHC) a/nebo in situ hybridizací (ISH). V případě nádorů s diskordantním fenotypem IHC+/ISH- jsou nádory zachyceny již v rámci prvotního testování, a pacientky tak mohou profitovat z anti-HER2 léčby. Naproti tomu nádory hodnocené v primární laboratoři jako IHC negativní (IHC-) nejsou dále testovány, a nelze proto zjistit, jaké je zastoupení nádorů, které jsou IHC-, avšak vykazují amplifikaci genu HER2 prokazatelnou pomocí ISH (ISH+) – tj. mají diskordantní fenotyp IHC-/ISH+, a mohly by tedy také reagovat na výše zmíněnou léčbu. Zároveň doposud neexistují relevantní data, která by srovnávala výsledky IHC vyšetření provedených v primárních a následně v referenčních laboratořích u nádorů, které byly v primární laboratoři hodnoceny jako IHC-.

Doposud neexistovala v ČR studie, která by se oběma výše položenými otázkami zabývala. Proto v průběhu roku 2010 proběhla studie, které se zúčastnilo celkem 22 pracovišť patologie, která rutinně provádějí IHC stanovení HER2. Tato pracoviště po dobu studie zasílala IHC- vzorky na kontrolní vyšetření, které bylo provedeno vždy v jedné ze 6 stávajících referenčních laboratoří, a to jak pomocí IHC certifikovaným kitem (ověření skutečné IHC negativity), tak pomocí ISH. U každého případu byl dále zaznamenáván histologický typ, grade, počet vyšetřených a počet pozitivních lymfatických uzlin, stav exprese receptorů pro estrogen a progesteron a proliferační aktivita (Ki67 antigen).

V rámci studie s prospektivním i retrospektivním sběrem vzorků z 22 pracovišť bylo vyšetřeno celkem 617 případů HER2 IHC- karcinomu prsu. IHC vyšetření v referenční laboratoři bylo shodné s primárním vyšetřením v 535 (86,7 %) případů. Z 82 (13,3 %) neshodných případů bylo 13 nádorů (2,1 %) HER2 silně pozitivních (3+) a 69 (11,2 %) slabě (hraničně) pozitivních. Z těchto 69 nádorů však jen 12 (1,9 %) vykazovalo amplifikaci pomocí ISH, zbylých 57 (9,3 %) bylo ISH negativních. Z celkového počtu 617 nádorů tedy byla klinicky signifikantní falešná negativita vyšetření v primární laboratoři prokázána jen v 25 případech (4 %), což je nepochybně příznivá zpráva. Z 535 (86,7 %) případů IHC- vykazovalo 13 (2,1 %) nádorů hraniční amplifikaci a 8 (1,3 %) nádorů jednoznačnou amplifikaci genu HER-2/neu pomocí ISH; celkem tedy bylo 21 (3,4 %) případů karcinomů prsu s diskordantním fenotypem (tj. imunohistochemicky HER2 negativních i při opakovaném vyšetření avšak s amplifikací genu potvrzenou in situ hybridizací). Podrobnější analýza dalších charakteristik této podskupiny nádorů ukázala, že se jednalo statisticky významně častěji o nádory zpravidla duktální či papilární karcinomy, vykazující částečnou či úplnou ztrátu hormonální dependence a spadající do kategorie pT2 či vyšší.

Studie tak prokázala nejen vysokou míru klinicky signifikantní shody mezi IHC vyšetřeními provedenými v primární versus referenční laboratoři (klinicky významná falešná negativita primárního vyšetření nepřesahovala 4 % případů), ale rovněž byla identifikována podskupina 3,4 % pacientek s velmi specifickým fenotypem IHC-/ISH+. Projekce těchto nálezů na celou populaci každoročně diagnostikovaných nádorů ukazuje, že takto by bylo možné nově zachytit až 275 pacientek, které mají šanci profitovat z biologické anti-HER2 cílené terapie. Zastoupení pacientek s nádory IHC-/ISH+ není natolik vysoké, aby bylo efektivní testovat pomocí ISH všechny karcinomy prsu bez ohledu na výsledek IHC, nebo současné testování pomocí IHC zcela nahradit in situ hybridizací.

Po vzájemné dohodě České onkologické společnosti a Společnosti českých patologů byl zahájen pilotní projekt sloužící k prospektivnímu ověření těchto poznatků. Nádory splňující výše uvedená kritéria budou i přes imunohistochemickou negativitu standardně vyšetřovány v referenčních laboratořích pomocí in situ hybridizace. Všichni patologové provádějící primární imunohistochemická vyšetření byli požádáni, aby k verifikaci do referenční laboratoře poslali nejen nádory IHC2+ nebo 3+, jak je současným standardem, ale též všechny nádory IHC negativní (0, 1+), pokud současně splňují obě níže uvedená kritéria:

  1. morfologie jiná než lobulární, tubulární či mucinózní (tedy zejména duktální, papilární a případně jiné vzácnější typy);
  2. negativita estrogenových či progesteronových receptorů, případně obou.

Závěr

Závěrem lze konstatovat, že v současné době stojíme před mnohými výzvami – s nárůstem poznatků na poli predikce odpovědi na cílenou léčbu se ukazuje, že celá situace je daleko komplexnější a nelze ji popsat schematickým vztahem “pozitivní marker = odpověď na terapii”

Literatura

  1. Vážan P, Velecký J, Gatěk J. Vyšetření sentinelových uzlin u karcinomu prsu pomocí rychlé peroperační biopsie a imunohistochemie v sériových řezech. Cesk Patol 2007;43(1):13-7.
  2. Tomšová M, Melichar B, Sedláková I, Nová M. Prognostické markery u ovariálního karcinomu – retrospektivní studie. Cesk Patol 2005;41(2):51-9.
  3. Barros FF, Powe DG, Ellis IO, Green AR. Understanding the HER family in breast cancer: interaction with ligands, dimerization and treatments. Histopathology 2010;56(5):560-72.
  4. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785):177-82.
  5. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007;25(1):118-45.
  6. Turashvili G, Bouchalova K, Bouchal J, Kolar Z. Expression of E-cadherin and c-erbB-2/HER-2/neu oncoprotein in high-grade breast cancer. Cesk Patol 2007;43(3):87-92.
  7. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med 2007;131(1):18.
  8. Carbone A, Botti G, Gloghini A, et al. Delineation of HER2 gene status in breast carcinoma by silver in situ hybridization is reproducible among laboratories and pathologists. J Mol Diagn 2008;10(6):527-36.
  9. Koh YW, Lee HJ, Lee JW, Kang J, Gong G. Dual-color silver-enhanced in situ hybridization for assessing HER2 gene amplification in breast cancer. Mod Pathol 2011.
  10. Brunelli M, Manfrin E, Martignoni G, et al. HER-2/neu assessment in breast cancer using the original FDA and new ASCO/CAP guideline recommendations: impact on selecting patients for herceptin therapy. Am J Clin Pathol 2008;129(6):907-11.
  11. Grimm EE, Schmidt RA, Swanson PE, Dintzis SM, Allison KH. Achieving 95% cross-methodological concordance in HER2 testing: causes and implications of discordant cases. American journal of clinical pathology 2010;134(2):284-92.
  12. Paik S, Kim C, Wolmark N. HER2 status and benefit from adjuvant trastuzumab in breast cancer. The New England Journal of Medicine 2008;358(13):1409-11.
  13. Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2- positive breast cancer. The New England Journal of Medicine 2005;353(16):1673-84.
  14. Dowsett M, Hanna WM, Kockx M, et al. Standardization of HER2 testing: results of an international proficiency-testing ring study. Mod Pathol 2007;20(5):584-91.
  15. Perez EA, Reinholz MM, Hillman DW, et al. HER2 and chromosome 17 effect on patient outcome in the N9831 adjuvant trastuzumab trial. Journal of Clinical Oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2010;28(28):4307-15.
  16. Ross JS. Human epidermal growth factor receptor 2 testing in 2010: does chromosome 17 centromere copy number make any difference? Journal of Clinical Oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2010;28(28):4293-5.
  17. Yeh IT, Martin MA, Robetorye RS, et al. Clinical validation of an array CGH test for HER2 status in breast cancer reveals that polysomy 17 is a rare event. Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 2009;22(9):1169-75.

Zdroj: RYŠKA, ALEŠ. Novinky v testování HER2 u karcinomu prsu. Breast Cancer News : časopis pro odborníky ve zdravotnictví. Srpen 2011, 1, 2, s. 13-17.

Související články

Breast Cancer News - srpen 2011 (roč. 1, č. 2)

Druhé číslo nového časopisu pro odborníky ve zdravotnictví.

Studie RIBBON-1 (Regimens in Bevacizumab for Breast Oncology) je randomizovaná, dvojitě slepá, placebem kontrolovaná klinická studie fáze III, porovnávající chemoterapeutické režimy s bevacizumabem nebo bez něj v 1. linii léčby lokálně pokročilého nebo metastatického karcinomu prsu bez exprese HER2.