Novinky v histopatologickém vyšetřování karcinomu prsu

Pro svůj zásadní význam při volbě optimálního terapeutického postupu jsou dnes do diagnostického standardu zahrnuty výsledky vyšetření exprese hormonálních receptorů (estrogenových a progesteronových), proliferačních markerů (v dnešní době takřka výhradně antigenu Ki67) a některých onkoproteinů (p53 či HER2/neu). Zejména otázky kolem vyšetřování posledně jmenovaného receptoru jsou v naší i světové literatuře velmi diskutovány.

PDF verze
Ve speciální příloze časopisu Farmakoterapie, ročník 6, říjen 2010 s názvem Biologická léčba HER2-pozitivních nádorů byly publikovány i další práce.

Úvod

Morfologické vyšetření a z něho vzešlá histopatologická diagnóza, zahrnující určení biologické povahy a přesného morfologického typu nádoru, stupně diferenciace (grade) a stupně pokročilosti (stage), je již po mnoho desetiletí zlatým standardem a jedním z klíčových parametrů, od kterých se odvíjí další léčebný postup u nemocných s jakýmkoliv nádorovým onemocněním. Poměrně nedávno byly u celé řady maligních nádorů tyto základní hodnocené parametry dále rozšířeny o výsledky mnoha různých doplňkových speciálních vyšetření, zejména z oblasti imunohistochemie a molekulární biologie. Toto platí také pro nejčastěji se vyskytující maligní novotvar u žen, karcinom prsu.

Pro svůj zásadní význam při volbě optimálního terapeutického postupu jsou dnes do diagnostického standardu zahrnuty výsledky vyšetření exprese hormonálních receptorů (estrogenových a progesteronových), proliferačních markerů (v dnešní době takřka výhradně antigenu Ki67) a některých onkoproteinů (p53 či HER2/neu).1 Zejména otázky kolem vyšetřování posledně jmenovaného receptoru jsou v naší i světové literatuře velmi diskutovány.2

Stanovení proteinu HER2 a jeho význam

Nejprve několik obecně známých a nepochybných fakt – protein HER2/neu (někdy také označovaný jako c-erbB-2) je členem širší rodiny receptorů epidermálního růstového faktoru, kam kromě HER2 patří také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4.3 Tyto čtyři molekuly jsou do značné míry homologní – mají extracelulární doménu, na kterou se váže ligand daný receptor aktivující, transmembránovou doménu a intracelulární efektorovou doménu. Ta vykazuje tyrosinkinázovou aktivitu, díky níž je signál předán k dalšímu zpracování. Nezbytnou podmínkou pro nastartování signální dráhy je dimerizace receptoru – buď dvou stejných molekul (homodimerizace), či dvou různých příslušníků rodiny HER (heterodimerizace). Jednotlivé molekuly se od sebe poněkud liší – právě HER2 je jediným členem rodiny, který není přímo aktivován svým ligandem (má „necitlivou“ či „slepou“ svou extracelulární doménu), ale podílí se nejochotněji z celé skupiny HER receptorů na procesu dimerizace. Aktivace signální dráhy vede ke zvýšené proliferaci, zablokování apoptózy, zvýšené vaskularizaci nádoru a vyššímu metastatickému potenciálu.

U některých nádorů (karcinomy prsu, slinných žláz, pankreatu, endometria, ovaria) je tento receptor zvýšeně exprimován – místo desítek tisíc molekul, které jsou přítomny na povrchu normálních epitelových buněk, je u nádorů s overexpresí HER2 na membráně nádorové buňky přítomno několik stovek tisíc až jeden milion kopií. Příčinou overexprese je v naprosté většině případů amplifikace genu HER-2/neu. Tento gen je lokalizován na 17. chromosomu a bývá amplifikován u zhruba 15 procent všech karcinomů prsu, významně častěji zejména u nádorů nízce diferencovaných, častěji u karcinomů duktálních než lobulárních. Ve větším počtu případů jsou nádory s overexpresí HER2 zároveň hormonálně independentní – tj. postrádají expresi estrogenových a progesteronových receptorů.

Až do 90. let minulého století byla zvýšená exprese HER2 považována pouze za negativní prognostický faktor – HER2-pozitivní nádory se chovají významně agresivněji, nemocní vykazují statisticky významně kratší dobu přežití. Avšak se zavedením trastuzumabu (Herceptin) do léčby se situace změnila. Trastuzumab je humanizovaná monoklonální protilátka cílená proti receptoru HER2, a proto jsou pro léčbu vhodné právě pacientky s agresivnějšími HER2-pozitivními nádory. Prognóza u pacientek s HER2- -pozitivním metastatickým karcinomem prsu je v případě neoadjuvantní léčby chemoterapií kombinovanou s trastuzumabem lepší než u pacientek, které mají nádor HER2-negativní a jsou léčeny neoadjuvantně pouze chemoterapií.4 Z čistě prognostického markeru se tak HER2 stal rovněž markerem prediktivním a jeho vyšetřování se ukázalo být zcela zásadním pro výběr těch pacientek, které jsou pro léčbu trastuzumabem vhodné.

HER2 lze v nádorové tkáni vyšetřovat dvěma principiálně odlišnými metodami – pomocí detekce proteinu metodou imunohistochemie (IHC), nebo pomocí detekce kopií genu v jádře metodou in situ hybridizace (ISH, nejčastěji fluorescenční – FISH, nověji chromogenní – CISH nebo SISH).

Právě zavedení nových metod hodnocení genu HER2 – CISH a SISH – je jednou z novinek, která přináší celou řadu výhod. Vzhledem k tomu, že je vyšetření prováděno v klasickém světelném mikroskopu, přináší tato novinka několik podstatných výhod. Při použití uvedených metod lze preparáty archivovat (nedochází ke ztrátě signálu, jako tomu je u FISH), hodnocení počtu kopií genu lze provádět v kontextu morfologie jednotlivých nádorových buněk, u nádorů, které jsou heterogenní, lze lépe stanovit procento buněk, které vykazují amplifikaci.5

Přitom CISH i SISH vykazují mimořádně dobrou shodu (přes 95 %) v naprosté většině studií srovnávajících je s klasickou FISH.6,7 Podobně jako FISH, lze i SISH použít také pro vyšetření cytologických nátěrů.8

Je třeba si uvědomit, že obě metody – ISH a IHC – principiálně slouží k hodnocení dvou odlišných struktur – genu a proteinu. Ve většině případů je výsledek obou vyšetření konkordantní (obě vyšetření pozitivní, nebo obě negativní), u menšiny nádorů se však lze setkat s výsledky diskordantními (jedno z vyšetření pozitivní, druhé negativní). Tyto diskordantní výsledky neznamenají nutně selhání – falešnou pozitivitu, či falešnou negativitu – jedné z metod. Příčiny mohou být (a často jsou) důsledkem inherentních biologických vlastností daného nádoru. U nádorů IHC+/ISH– jde nejčastěji o případy, kdy zvýšená exprese proteinu je způsobena nikoli amplifikací genu, ale polysomií chromosomu 17 v nádorové buňce, u nádorů IHC–/ISH+ může jít o důsledek změn struktury proteinu, který je následně imunohistochemicky nedetekovatelný.9

Analýza dat získaných ze studie HERA ukazuje, že účinek léčby trastuzumabem nezávisí na stupni amplifikace genu, ať již hodnoceném pomocí indexu HER2/CEP17 (poměr počtu signálů vlastního genu k počtu signálů centromerické oblasti 17. chromosomu), nebo pomocí absolutního počtu kopií genu HER2.10

Diagnostika HER2 byla zahrnuta do rutinního standardu vyšetření karcinomu prsu, a tak každý nově diagnostikovaný případ je kromě všech ostatních vyšetření také podroben IHC detekci HER2. U těch nádorů, které jsou při tomto vyšetření pozitivní, je dále výsledek ověřen v jedné ze šesti referenčních laboratoří, které byly pro toto vyšetření v ČR vybrány, a to jak opakovanou IHC, tak navíc i pomocí ISH. Kromě případů jasně pozitivních jsou do referenčních laboratoří odesílány i případy „hraničně“ či „sporně“ pozitivní. Síť těchto referenčních laboratoří byla vytvořena již před dvěma roky a její fungování se jednoznačně osvědčilo – laboratoře jsou akreditovány, musí používat výhradně certifikované kity a podrobovat se pravidelnému externímu hodnocení kvality metodou vyšetřování anonymních slepých vzorků. Při tomto externím hodnocení kvality dosahují laboratoře vesměs shody v 95 % a více případů.

Samozřejmě že i nadále zůstává IHC metodou, která v sobě nese určité prvky subjektivity (8) a je výrazně citlivější na zacházení se tkání v preanalytické fázi vyšetření (zejména důležitá je adekvátní fixace materiálu – její optimální délka je 24 hodin). Zajímavé však je, že pokud je patolog, který IHC vyšetření provádí, řádně proškolený a v dané problematice zkušený, je interindividuální variabilita poměrně nízká a shoda mezi hodnotiteli je podobná jako mezi přístroji využívajícími metodu počítačové analýzy obrazu, či dokonce lepší.11

Je celá řada otázek, které v současnosti zůstávají nezodpovězeny, a nalezení odpovědí není v některých případech úplně snadné. Za všechny lze uvést tři příklady:

  1. Jaký je skutečný výskyt HER2-pozitivních karcinomů prsu v ČR?
    Na tuto otázku, jakkoli se zdá být zcela banální a snadno řešitelná, neexistuje doposud odpověď, jež by se opírala o validní data. Vzhledem k tomu, že v centrálních registrech doposud není (a pravěpodobně z „technických“ či spíše „metodických“ důvodů ani nikdy nebude) údaj o HER2-pozitivitě evidován, není z čeho vycházet. Odpověď nemohou poskytnout ani specializované registry lékové, neboť tam jsou zadávány pouze pacientky, které byly léčeny určitým typem léku, je však jisté, že jejich počet je nižší než celkový počet HER2-pozitivních (z důvodů odmítnutí léčby, nejrůznějších kontraindikací apod.).
    Z tohoto důvodu se Společnost českých patologů ČLS JEP rozhodla zavést centrální registr morfologicky vyšetřených karcinomů prsu, kam budou zadávány všechny nově diagnostikované případy karcinomu prsu. V současné době registr již běží v pilotním režimu a je postupně zprovozňován v referenčních laboratořích. Po ověření bezproblémového fungování bude plošně zprovozněn na všech pracovištích patologie. Po přibližně jednom roce provozu již budeme schopni velmi přesně říci, jaké je skutečné procento nádorů HER2-pozitivních. Vzhledem k tomu, že bude kromě výsledku vyšetření HER2 v primární laboratoři zaznamenáván i výsledek z laboratoře referenční, nebude problémem identifikovat případy, u kterých se oba výsledky lišily. Všechny tyto informace budou důležité nejen pro samotné laboratoře (bude možné zpětně analyzovat, jak se liší frekvence HER2-pozitivity mezi jednotlivými pracovišti, najít ta pracoviště, kde se vyskytuje výrazně častěji neshoda mezi výsledkem vlastním a referenčním, a tím popřípadě nalézt ty laboratoře, které musí zlepšit svou metodiku), ale také pro onkology a plátce zdravotní péče, neboť bude mnohem snazší predikovat počty nemocných vhodných pro biologickou léčbu, a tím přesněji odhadnout potřebné náklady, které si tato léčba vyžádá.
  2. Jsou skutečně všechny nově diagnostikované karcinomy prsu vyšetřeny v plném rozsahu?
    Přestože již několik let platí Standard morfologického vyšetření nádorů prsu, který publikovala po rozsáhlé odborné diskusi Společnost patologů, a tento standard je závazným materiálem, není možné jednoznačně a neochvějně tvrdit, že nikdy není opomenuto provedení toho či onoho dílčího vyšetření. Na otázku přinese opět odpověď výše zmíněný registr, do kterého je zaznamenávána celá řada detailních údajů – kromě TNM klasifikace také výsledky vyšetření hormonálních receptorů, proliferační aktivity a HER2. Velmi snadno tak bude možné najít případy, kdy vyšetření nebylo provedeno kompletně – ať již z důvodů objektivních (špatná fixace materiálu na chirurgii, malé množství nádorové tkáně v punkčním vzorku apod.), či z důvodů opomenutí.
  3. Jak velký je počet karcinomů prsu, které jsou IHC–/ISH+?
    Vzhledem k současnému stavu (jistě opodstatněnému a racionálně podloženému), kdy do referenčních laboratoří jsou posílány pouze případy zachycené jako IHC-pozitivní či sporně pozitivní (a ty jsou následně vyšetřeny certifikovanými kity IHC a ISH), nádory, které jsou primárně IHC-negativní, se již pomocí ISH nevyšetřují. Z literatury přitom vyplývá, že i nádory, které jsou IHC–/ISH+, mohou reagovat na anti-HER2 léčbu obdobně jako nádory IHC+.10
    Z tohoto důvodu byla zahájena studie, v níž po omezenou dobu posílají primární pracoviště do referenčních laboratoří i případy, které jsou IHC–, a ty jsou následně testovány stejným algoritmem jako nádory původně pozitivní (tj. IHC certifikovaným kitem a následně ISH). Tento projekt bude ukončen v průběhu září.

Budoucnost vyšetřování HER2

Kromě nepochybně narůstajícího (a oprávněného) tlaku kliniků – zejména onkologů – na zpřesňování a standardizaci laboratorních metod, což by mělo vést ke zvyšování validity histopatologického vyšetřování, přinese budoucnost nepochybně zavádění nových markerů do rutinní diagnostiky. Je jistě daleko nad rámec tohoto textu jmenovat molekuly, které by mohly být v blízké budoucnosti užitečné v přesnější stratifikaci pacientů k volbě optimálního terapeutického přístupu – uvedeme alespoň jeden příklad za všechny.

Z pacientek, které mají HER2-pozitivní karcinom prsu, zareaguje na léčbu trastuzumabem přibližně jedna třetina.10,12 Jedním z vysvětlení, proč některé nádory jsou rezistentní k této léčbě, přestože obsahují cíl, proti kterému je lék zaměřen, by mohla být změněná struktura molekuly vlastního receptoru. V některých případech je exprimován receptor, jehož extracelulární doména je zkrácená (tento defektní receptor je označován jako protein p95HER2 či zkráceně jen p95).13 Receptor je sice detekovatelný pomocí IHC, vazebné místo pro trastuzumab ale molekula postrádá. Paradoxně má přitom vzhledem k změněné konformaci vyšší tendenci k dimerizaci, a tím dokonce vyšší potenciál stimulovat nádorové buňky k růstu, než „normální“ molekula HER2.2

V literatuře se již objevily první práce popisující IHC detekci p95, což by v budoucnosti umožnilo identifikaci těch nádorů, které budou s velkou pravděpodobností rezistentní vůči léčbě trastuzumabem, avšak bude u nich možné (vzhledem k zachované intracelulární tyrosinkinázové aktivitě) použít malomolekulární intracelulární inhibitory (např. lapatinib).12 Teprve další prospektivní studie však ozřejmí, jaká je senzitivita a specificita průkazu p95, a zda tedy bude tento marker použitelný v běžné klinické praxi.

Literatura

  1. Brunelli M, Manfrin E, Martignoni G, et al. HER-2/neu assessment in breast cancer using the original FDA and new ASCO/CAP guideline recommendations: impact on selecting patients for herceptin therapy. Am J Clin Pathol 2008;129:907–11.
  2. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16:173–82.
  3. Barros FF, Powe DG, Ellis IO, et al. Understanding the HER family in breast cancer: interaction with ligands, dimerization and treatments. Histopathology 2010;56:560–72.
  4. Dawood S, Broglio K, Buzdar AU. Prognosis of women with metastatic breast cancer by HER2 status and trastuzumab treatment: an institutional-based review. J Clin Oncol 2010;28:92–8.
  5. Gruver AM, Peerwani Z, Tubbs RR. Out of the darkness and into the light: bright field in situ hybridisation for delineation of ERBB2 (HER2) status in breast carcinoma. J Clin Pathol 2010;63:210–9.
  6. Papouchado BG, Myles J, Lloyd RV, et al. Silver in situ hybridization (SISH) for determination of HER2 gene status in breast carcinoma: comparison with FISH and assessment of interobserver reproducibility. Am J Surg Pathol 2010;34:767–76.
  7. Riethdorf S, Hoegel B, John B, et al. Prospective multi-centre study to validate chromogenic in situ hybridisation for the assessment of HER2 gene amplification in specimens from adjuvant and metastatic breast cancer patients. J Cancer Res Clin Oncol 2010.
  8. Fritzsche FR, Bode PK, Moch H, et al. Determination of the Her-2/neu gene amplification status in cytologic breast cancer specimens using automated silver-enhanced in-situ hybridization (SISH). Am J Surg Pathol 2010;34:1180–5.
  9. Grimm EE, Schmidt RA, Swanson PE, et al. Achieving 95% cross-methodological concordance in HER2 testing: causes and implications of discordant cases. Am J Clin Pathol 2010; 134:284–92.
  10. Dowsett M, Procter M, McCaskill-Stevens W, et al. Disease-free survival according to degree of HER2 amplification for patients treated with adjuvant chemotherapy with or without 1 year of trastuzumab: the HERA Trial. J Clin Oncol 2009;27:2962–9.
  11. Turashvili G, Leung S, Turbin D, et al. Inter-observer reproducibility of HER2 immunohistochemical assessment and concordance with fluorescent in situ hybridization (FISH): pathologist assessment compared to quantitative image analysis. BMC Cancer 2009;9:165.
  12. Sperinde J, Jin X, Banerjee J, et al. Quantitation of p95HER2 in paraffin sections by using a p95-specific antibody and correlation with outcome in a cohort of trastuzumab-treated breast cancer patients. Clin Cancer Res 2010;16:4226–35.
  13. Arribas J, Parra-Palau JL, Pedersen K. HER2 fragmentation and breast cancer stratification. Clin Cancer Res 2010;16:4071–3.

Související články

Pan profesor Ryška, předseda Společnosti českých patologů, představil na Brněnských onkologických dnech aktualizovaná doporučení pro zpracování a vyšetření bioptických vzorků prsu. Přednáška byla zaměřena především na novinky ve vyšetřování HER2/neu u karcinomů prsu. Dozvíte se, jaká je incidence HER2+ karcinomů v naší populaci, její závislost na věku pacientek, jaké novinky guideliny přináší pro rozhodování onkologů o léčbě a vyzkoušíte si, zda umíte v souladu s novými guideliny správně interpretovat výsledky z laboratoře a rozhodnout na jejich základě o dalším postupu.   

 

Přednáška přináší korekce predikcí počtu HER-2+ karcinomů na základě analýzy dat histologického registru karcinomů prsu (MAGISTER), který již obsahuje cca 5 tisíc podrobných záznamů.

Čím vyšší procento ženské populace bude ve screeningu aktivní, tím bude četnost časně zachycených karcinomů prsu větší a úmrtnost na tuto diagnózu nižší. Další navýšení účasti českých žen ve screeningu je velice pravděpodobně možné dosáhnout jen systémem adresného zvaní tak, jak toho bylo dosaženo i v jiných, zejména severských státech Evropy.